磷脂酶Cγ1在大腸癌細胞遷移和細胞—基質粘附中的作用及信號轉導機制.pdf

1、該課題以大腸癌細胞為研究模型，利用細胞生物學和分子生物學相關的技術手段，研究了PLCγ1與大腸癌細胞與基質粘附、PLCγ1與大腸癌細胞的遷移能力間的關系及其發(fā)揮作用的信號轉導機制，以期為闡明大腸癌侵襲和轉移的機制，尋找治療的靶位點提供理論和實驗依據(jù)。 該研究首先利用逆轉錄病毒表達載體pLNCX2構建了人PLCγ1編碼區(qū)cDNA真核表達載體pLNCX2/PLCγ1及PLCγ1顯性負突變片段PLCz的真核表達載體pLNCX2/PLC

2、z，經PCR，限制性內切酶酶切分析和DNA序列測定鑒定后，轉染至人大腸癌細胞LoVo中，并在mRNA及蛋白水平檢測了PLCγ1及PLCz的表達。同時，利用PLC特異抑制劑U73122，分別研究了PLCγ1功能活性的抑制對人大腸癌細胞粘附及細胞遷移能力的影響。最后，該研究采用蛋白印跡(Westernblot)，凝膠遷移率變動分析(gelelectrophoresismobilityshiftassay，EMSA)，免疫細胞化學，酶譜分析及

3、RT-PCR(reversetranscriptionPCR)等技術，進一步分析了大腸癌細胞在表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)刺激作用下PLCγ1介導的細胞粘附、細胞遷移作用的胞內信號轉導機制，及其對下游相關信號分子的活性和表達的影響。 主要結果和結論： 1.成功構建了人PLCγ1基因全長編碼區(qū)cDNA真核表達載體pLNCX2/PLCγ1及PLCγ1顯性負突變片段PLCz的真核表達載體p

4、LNCX2/PLCz。所構建的真核表達載體經PCR，限制性內切酶酶切分析和DNA序列測定證明是正確的。經脂質體LipofectamineTM2000介導轉染包裝細胞PT67，以產生的病毒感染LoVo細胞。經RT-PCR及蛋白印跡分析顯示，與未轉染組、pLNCX2轉染組及pLNCX2/PLCz轉染組相比，轉染pLNCX2/PLCγ1的LoVo細胞中PLCγ1的表達在mRNA和蛋白質水平均有明顯增高。在pLNCX2/PLCz轉Ⅱ染組中除可檢

5、測到內源性PLCγ1的表達外，還有外源性顯性負突變片段PLCz的表達，而在其它各組中則不能檢測到PLCz的表達。結果表明該實驗成功構建了人PLCγ1基因全長編碼區(qū)cDNA真核表達載體pLNCX2/PLCγ1及PLCγ1顯性負突變片段PLCz的真核表達載體pLNCX2/PLCz，且構建的兩種真核表達載體均可以在大腸癌細胞中表達，從而為進一步研究PLCγ1在大腸癌中的作用奠定了基礎。 2.該實驗采用體外損傷愈合分析進一步研究了PLC

6、γ1對于高轉移的LoVo細胞體外遷移能力的影響。結果顯示，用不同劑量的PLC抑制劑U73122(1μM，2.5μM，5μM)處理也可顯著降低LoVo細胞的遷移能力。與對照組遷移率(100％)相比，不同劑量的U73122(1μM，2.5μM，5μM)處理可使細胞的遷移率((實驗組遷移細胞數(shù)/對照組遷移細胞數(shù))％)分別降到88.49±2.68％，69.91±0.97％，41.62±3.59％(P＜0.05)，亦呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性的下降。

7、說明，在高轉移大腸癌細胞中，細胞與基質的粘附及細胞的遷移能力均受到PLCγ1的調節(jié)。 3.實驗中檢測了EGF是否在PLCγ1對LoVo細胞遷移和粘附能力的調節(jié)中發(fā)揮作用。不同劑量的EGF(5nM,10nM,20nM)處理細胞后，蛋白印跡分析顯示，EGF可通過對PLCγ1的磷酸化而激活PLCγ1，且表現(xiàn)出劑量依賴性，提示在大腸癌細胞中存在激活的EGFR-PLCγ1信號通路。其中20nMEGF處理后，PLCγ1的磷酸化水平增加最顯著

8、，因此后續(xù)實驗均采用20nMEGF處理細胞。粘附分Ⅲ析及體外損傷愈合分析顯示，在LoVo細胞中，EGF可促進細胞對纖連蛋白的粘附和細胞的遷移，而且，EGF對U73122在細胞與基質粘附及細胞遷移方面的抑制效應有一定的拮抗作用。 4.該實驗對于NF-κB在大腸癌細胞粘附和遷移中的作用，及PLCγ1與NF-κB之間的關系進行了研究。不同濃度的NF-κB抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，P

9、DTC)(50μM，100μM，150μM，200μM)處理LoVo細胞后，細胞對基質的粘附呈現(xiàn)出劑量依賴性的下降。OD450從對照組的2.148±0.094分別下降至1.587±0.328，1312±0.192，1.115±0.177，0.961±0.151(P＜0.05)。同時，PDTC處理也可抑制細胞的遷移，而EGF則可以部分恢復PDTC所造成的細胞遷移率的下降。此外，EMSA和免疫細胞化學的結果也進一步證實了EGF對NF-κB的

10、激活部分依賴于PLCγ1。 5.該實驗研究了LoVo細胞中PLCγ1和NF-κB對Hsp70表達的影響。細胞經過不同的處理： (1)用不同濃度的U73122(1μM，2.5μM，5μM)處理。 (2)用不同濃度的U73122(1μM，2.5μM，5μM)處理30min后，再以EGF(20nM)刺激30min。 (3)以U73122(2.5μM)處理不同時間(0，0.5，1，4，8，12h)。 (4

11、)以PDTC(100μM)處理不同時間(0，0.5，1，4，8，12h)。提取不同處理組細胞總蛋白，檢測Hsp70的表達。蛋白印跡分析顯示，抑制PLCγ1和NF-κB均可上調Hsp70的表達，但抑制效應有所不同。抑制PLCγ1對Hsp70表達的上調作用持續(xù)時間較長，從抑制劑作用30min后開始，直到抑制劑作用12h，Hsp70表達仍高于對照組。抑制NF-κB后，抑制劑作用30min后，Hsp70表達同樣增高，但在4h后即恢復至對照水平。

12、考慮到NF-κB是一個轉錄因子家族，受到多種分子的調節(jié)，推測這種差異可能是由于其它的信號分子在一定程度上彌補了PDTC對NF-κB的抑制作用，從而導致Hsp70的表達較快恢復至正常水平。 6.該實驗利用RT-PCR及酶譜分析的方法對這二者的表達及活性進行了研究。LoVo細胞經不同濃度的PLCγ1抑制劑U73122或NF-κB抑制劑PDTC處理30min后，再在有或無20nMEGF的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。提取不同處理的LoVo細

13、胞的RNA進行RT-PCR，結果表明，EGF，U73122，PDTC對MMP-2和TIMP-2在mRNA水平的表達無顯著影響。利用該實驗所構建的人PLCγ1基因編碼區(qū)cDNA真核表達載體pLNCX2/PLCγ1及PLCγi顯性負突變片段PLCz的真核表達載體pLNCX2/PLCz轉染LoVo細胞，提取RNA進行RT-PCR，也證實了這一結論。同時，酶譜分析證實，EGF，U73122，PDTC對MMP-2酶原的表達及激活也無顯著的調節(jié)作用

14、。因此，MMP-2，TIMP-2不是EGFR-PLCγ1-NF-κB信號通路的下游分子。 綜合結果提示，在高轉移的人大腸癌細胞與基質的粘附及細胞的遷移中，PLCγ1均作為一個重要的信號分子發(fā)揮作用，并可能通過影響細胞的粘附及運動能力進而影響腫瘤細胞的侵襲和轉移。EGF可以通過磷酸化PLCγ1進一步調節(jié)NF-κB的活性，共同參與這一過程。同時，Hsp70位于EGFR-PLCγ1-NF-κB信號通路的下游，受其負調節(jié)。而MMP-2，