胚胎PAPPA,poFUT1的表達調(diào)控與胚胎著床相關(guān)性的研究.pdf

1、目的與意義：人胚胎的發(fā)育成熟及著床是一個復(fù)雜的過程。其過程包括:受精卵形成，并沿著輸卵管向子宮腔內(nèi)移動，同時伴隨卵裂。經(jīng)歷2-細胞期，4-細胞期，8-細胞期后，逐漸發(fā)育形成含有多個細胞的桑椹胚，最終發(fā)育為成熟的胚泡。成熟的胚泡進入子宮腔內(nèi)之后，與子宮內(nèi)膜相互作用，開始胚胎著床過程。胚胎著床的過程主要包括三個步驟，即胚泡的定植，胚泡與子宮內(nèi)膜的黏附及胚泡侵入子宮內(nèi)膜的過程。胚胎的發(fā)育成熟及著床是建立和維持妊娠的關(guān)鍵步驟。這一過程中，胚胎和

2、內(nèi)膜階段特異地表達的分子，參與調(diào)控胚胎發(fā)育成熟及著床過程。
　　妊娠相關(guān)血漿蛋白A(pregnancy-associated plasma proteinA，PAPPA)是由胎盤所分泌的一種蛋白質(zhì)。PAPPA在妊娠的第五周孕婦的血清中可以檢測到，隨著妊娠過程的進行，血清中的PAPPA含量持續(xù)升高，至妊娠末期達到峰值。研究發(fā)現(xiàn)，在早孕期，PAPPA的水平與許多疾病，如先兆流產(chǎn)等的發(fā)生密切相關(guān)，這提示我們PAPPA可能在妊娠早期有重要

3、的作用，但是目前還沒有關(guān)于PAPPA與胚胎的發(fā)育成熟和著床的相關(guān)性的報道。
　　糖基轉(zhuǎn)移酶及其產(chǎn)物與胚胎發(fā)育，炎癥反應(yīng)，腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程密切相關(guān)。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是糖基轉(zhuǎn)移酶家族的重要成員。根據(jù)催化合成糖基化位點的不同，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族(Fucosyltransferases，F(xiàn)UTs)主要有兩大類:一類是催化合成N-巖藻糖苷鍵的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，如FUT4、FUT7等;另一類是催化合成O-巖藻糖苷鍵的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（protei

4、n O-fucosyltransferases，poFUTs），如poFUT1和poFUT2。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT4和FUT7在胚胎著床過程中有重要作用，關(guān)于poFUT1和poFUT2在胚胎著床過程中的作用及機制尚無報道。
　　激素和細胞因子在胚胎發(fā)育成熟及著床過程中發(fā)揮重要作用。其中，孕酮和白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)的作用尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，孕酮在卵裂期能促進胚胎細胞的增殖而促進胚

5、胎的發(fā)育成熟。此外，LIF通過增加胚胎的滋養(yǎng)層細胞的侵襲能力而促進胚胎著床。孕酮和LIF均可以與其受體結(jié)合，參與調(diào)節(jié)與胚胎發(fā)育成熟和著床相關(guān)的多種因子的表達。
　　本文通過對PAPPA和poFUT1的表達調(diào)控的研究，探討PAPPA和poFUT1及其上游分子孕酮和LIF在胚胎發(fā)育成熟和著床過程中的作用，為臨床判斷胚胎的質(zhì)量及診斷先兆流產(chǎn)提供新的思路和理論依據(jù)。
　　實驗方法：
　?。ㄒ唬┤焉锵嚓P(guān)血漿蛋白A的表達調(diào)控與胚胎

6、著床相關(guān)性的研究
　　1.ELISA分析孕婦血清中PAPPA水平與孕酮的表達水平;
　　2.RT-PCR檢測人絨毛及蛻膜組織中PAPPA的表達水平;
　　3.WB檢測人絨毛及蛻膜組織中PAPPA的表達水平;
　　4.免疫組化和免疫熒光檢測人絨毛及蛻膜組織中PAPPA的表達水平;
　　5.Real-time PCR及ELISA檢測人滋養(yǎng)層細胞(JAR)中PAPPA的表達水平;
　　6.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染瞬時

7、轉(zhuǎn)染PAPPA siRNA至JAR細胞中，下調(diào)PAPPA的表達;
　　7.CCK-8及細胞計數(shù)分析細胞的增殖能力;
　　8.采用體外胚胎黏附模型檢測JAR細胞的黏附能力。
　?。ǘ㎡-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達調(diào)控與胚胎著床相關(guān)性的研究
　　1.免疫組化檢測正常早孕及先兆流產(chǎn)婦女的絨毛組織中poFUT1和poFUT2的表達水平;
　　2.ELISA檢測正常早孕及先兆流產(chǎn)婦女的血清中LIF的表達水平;
　　

8、3.免疫熒光檢測JAR細胞中poFUT1的表達水平;
　　4.Real-time PCR檢測JAR細胞的poFUT1的表達水平;
　　5.WB檢測JAR細胞的poFUT1的表達水平;
　　6.Transwell法分析JAR細胞的遷移和侵襲能力;
　　7.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法瞬時轉(zhuǎn)染poFUT1 siRNA至JAR細胞中，下調(diào)poFUT1的表達;
　　8.明膠酶譜實驗分析JAR細胞中MMP-2的活性;

9、　　9.WB檢測JAR細胞中TIMP-1/-2，STAT和PI3K/Akt信號通路的相關(guān)分子的表達。
　　結(jié)果：
　　（一）妊娠相關(guān)血漿蛋白A的表達調(diào)控與胚胎著床相關(guān)性的研究
　　1.孕婦血清中PAPPA的表達與血清中的孕酮水平相關(guān);
　　2.PAPPA僅在人絨毛組織中的表達;
　　3.孕酮可以促進JAR細胞中的PAPPA的表達;
　　4.下調(diào)PAPPA的表達可以抑制JAR細胞的黏附與增殖;
　

10、　5.孕酮通過上調(diào)JAR細胞中PAPPA的表達而促進JAR細胞的黏附與增殖。
　?。ǘ㎡-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達調(diào)控與胚胎著床相關(guān)性的研究
　　1.poFUT1和poFUT2在絨毛組織中表達，并且在先兆流產(chǎn)組的poFUT1的表達水平低于正常早孕組;
　　2.先兆流產(chǎn)組血清中LIF的表達水平低于正常早孕組;
　　3.poFUT1在JAR細胞中表達;
　　4.poFUT1的表達與絨毛組織和JAR細胞遷移，侵襲能

11、力相關(guān);
　　5.LIF上調(diào)JAR細胞中poFUT1的表達;
　　6.LIF通過上調(diào)poFUT1的表達促進體外培養(yǎng)的絨毛組織和JAR細胞的遷移及侵襲能力;
　　7.LIF通過poFUT1介導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路促進JAR細胞的遷移以及侵襲能力。
　　結(jié)論：
　　（一）妊娠相關(guān)血漿蛋白A的表達調(diào)控與胚胎著床相關(guān)性的研究
　　1.孕婦血清中PAPPA的表達與孕酮水平呈正相關(guān);
　　2.PAPP

12、A僅在人絨毛組織中表達;
　　3.在JAR細胞中，孕酮可以上調(diào)PAPPA的表達;
　　4.在體外黏附模型中，PAPPA可以促進JAR細胞的黏附與增殖。
　?。ǘ㎡-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達調(diào)控與胚胎著床相關(guān)性的研究
　　1.poFUT1和LIF在先兆流產(chǎn)病人的血清中表達下降;
　　2.LIF上調(diào)JAR細胞中poFUT1基因的表達;
　　3.poFUT1促進人絨毛組織和人滋養(yǎng)層細胞的遷移及侵襲能力;