胚胎血紅蛋白基因變異與自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　 自然流產(chǎn)是育齡婦女最常見(jiàn)的疾患之一。生育年齡的婦女，15～20％的臨床妊娠以自然流產(chǎn)為結(jié)局；包括生化妊娠在內(nèi)自然流產(chǎn)發(fā)生率可達(dá)30％～40％；約5％的育齡婦女會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。自然流產(chǎn)發(fā)生的危險(xiǎn)性隨著妊娠丟失次數(shù)的增加而增加，在連續(xù)2次胚胎丟失后，第三次胚胎丟失的危險(xiǎn)性高達(dá)80％。
　　 自然流產(chǎn)尤其是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜，遺傳學(xué)異常、免疫因素是早期自然流產(chǎn)的主要原因，內(nèi)分泌異常、解剖學(xué)異常、凝血功能異常、感

2、染等亦被認(rèn)為可導(dǎo)致自然流產(chǎn)，但即使經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病因檢查，仍然有40～60％的自然流產(chǎn)病因不明。探討自然流產(chǎn)的發(fā)病成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)倍受關(guān)注的研究方向之一。
　　 RSA多數(shù)發(fā)生于妊娠的12周內(nèi)，對(duì)于早期胚胎，在絨毛膜絨毛血管發(fā)生并建立有效胎盤(pán)循環(huán)之前，卵黃囊循環(huán)為胚胎發(fā)育提供穩(wěn)定有效的營(yíng)養(yǎng)、氧氣支持。擴(kuò)散至胚外體腔的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氧氣依賴(lài)卵黃囊循環(huán)運(yùn)送至胚胎體內(nèi)，胚胎處于低氧狀態(tài)，任何原因造成血氧供應(yīng)不足，都可影響胚胎發(fā)育甚至導(dǎo)致胚胎丟

3、失。胚胎血紅蛋白作為胚胎期主要的攜氧供氧載體，對(duì)胚胎的正常發(fā)育非常重要。
　　 人類(lèi)血紅蛋白基因表達(dá)有著嚴(yán)格的時(shí)空特異性，在個(gè)體不同的發(fā)育階段，基因簇上各個(gè)類(lèi)α、β珠蛋白基因按其在染色體上自5'-3'的排列順次表達(dá)。ζ和ε基因表達(dá)于胚胎早期，該基因幾乎存在于所有哺乳動(dòng)物基因中，提示此基因在物種進(jìn)化淘汰中更具有生存優(yōu)勢(shì)；且ζ、ε基因表達(dá)時(shí)間與臨床上自然流產(chǎn)高發(fā)時(shí)間段一致，推測(cè)該基因與自然流產(chǎn)發(fā)生具有高度相關(guān)性。這兩個(gè)基因由于自身突

4、變或在微環(huán)境干擾下表達(dá)異?；蚴Ш?，是否為自然流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的重要途徑，是一個(gè)值得探討的課題。本課題將通過(guò)對(duì)自然流產(chǎn)胚胎中ε、ζ基因進(jìn)行突變及多態(tài)性篩查，以探討該基因變異與自然流產(chǎn)的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 1.樣本收集：
　　 2008年3月-2009年4月在中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院黃埔院區(qū)婦產(chǎn)科門(mén)診人流室行人流清宮術(shù)的婦女，無(wú)菌收集其絨毛組織。其中，研究組40例，平均年齡28.2歲，自然受孕，平素月經(jīng)周

5、期規(guī)則，末次月經(jīng)記憶準(zhǔn)確，既往有或無(wú)類(lèi)似病史，B超提示：胚胎停止發(fā)育，胚胎停育時(shí)孕周為6～8周；對(duì)照組35例，平均年齡27.5歲，自然受孕，平素月經(jīng)周期規(guī)則，末次月經(jīng)記憶準(zhǔn)確，至少有一次成功妊娠史，B超證實(shí)宮內(nèi)妊娠存活，孕周為6～8周，既往無(wú)自然流產(chǎn)史。
　　 另外補(bǔ)充收集母體外周血標(biāo)本。研究組收集2009年4月-2009年10月在中山大學(xué)干細(xì)胞中心研究所進(jìn)行主動(dòng)免疫治療的婦女外周血50例，平均年齡27.8歲，有≥2次以上不明原

6、因自然流產(chǎn)病史，平均流產(chǎn)次數(shù)為3.1次。對(duì)照組收集2009年4月-2009年10月在中山大學(xué)一院黃埔院區(qū)體檢中心進(jìn)行體檢的婦女外周血50例，平均年齡28.3歲，既往至少有一次成功妊娠史，否認(rèn)有自然流產(chǎn)史或死胎史。
　　 無(wú)菌收集新鮮絨毛的胚胎組織約50-100mg，無(wú)菌生理鹽水漂洗去除母體血污染，置于EP管內(nèi)，-80℃保存；無(wú)菌收集外周血標(biāo)本約2ml，置于EP管內(nèi)，-80℃保存。
　　 2.提取DNA：
　　 根

7、據(jù)AXYGEN DNA提取試劑盒說(shuō)明按步驟提取DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液的純度及濃度。
　　 3.引物設(shè)計(jì)：
　　 從UCSC Genome Bioinformatics數(shù)據(jù)庫(kù)中提取ε基因、ζ基因相關(guān)序列作為標(biāo)準(zhǔn)序列。運(yùn)用Primer Premier5軟件，針對(duì)3個(gè)外顯子及部分內(nèi)含子、上游調(diào)控序列分片段設(shè)計(jì)引物。
　　 4.PCR擴(kuò)增目的片段：
　　 取絨毛組織DNA2ul PCR擴(kuò)增各個(gè)目的片

8、段，反應(yīng)程序按TaKaRa rTaq酶試劑盒程序說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取母體外周血DNA2ul擴(kuò)增絨毛組織DNA篩選出的異?；蚱巍?br>　　 5.電泳：
　　 每個(gè)PCR產(chǎn)物各取5ul加樣至2％的瓊脂糖凝膠樣品槽孔中電泳。通過(guò)UVPTransilluminator凝膠掃描系統(tǒng)(M-26)成像，紫外燈下觀察電泳膠板，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker)比較，判斷PCR結(jié)果。
　　 6.測(cè)序：
　　 應(yīng)用ABI公司的ABI P

9、rism3100-Avant遺傳分析儀對(duì)絨毛組織DNA PCR產(chǎn)物純化測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)CLUSTALX軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，確定突變位點(diǎn)及突變性質(zhì)。
　　 7統(tǒng)計(jì)分析：
　　 所有數(shù)據(jù)均用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立的兩組二分類(lèi)資料比較，采用卡方檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩變量關(guān)聯(lián)性分析，采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:

10、　　 1、胚胎絨毛組織ε、ζ基因篩查共6個(gè)外顯子片段未發(fā)現(xiàn)突變。
　　 2、胚胎絨毛組織ε基因第一內(nèi)含子84位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)插入4bpCAAA序列，該變異同時(shí)出現(xiàn)在研究組中及對(duì)照組中，兩組基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、胚胎絨毛組織ζ基因第一內(nèi)含子128位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)插入58bp序列，該變異同時(shí)出現(xiàn)于研究組中及對(duì)照組中，兩組基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，關(guān)聯(lián)性分析提示該基因片段變異與自然流產(chǎn)相關(guān)。
　　 4、胚胎絨

11、毛組織ζ基因變異研究組中出現(xiàn)2例純合子，對(duì)照組僅出現(xiàn)雜合子，純合子基因型頻率兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、胚胎絨毛組織自然流產(chǎn)1次組與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組ζ基因變異基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、母體外周血ζ基因第一內(nèi)含子58bp插入變異篩查，該變異同時(shí)出現(xiàn)在研究組及對(duì)照組，兩組基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，關(guān)聯(lián)性分析提示該基因片段變異與自然流產(chǎn)相關(guān)。
　　 7、母體外周血ζ基因第一內(nèi)含子58bp插入變異研

12、究組中出現(xiàn)2例純合子，對(duì)照組僅出現(xiàn)雜合子，純合子基因型頻率兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、ζ基因第一內(nèi)含子存在一58bp插入序列，該基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)相關(guān)。
　　 2、ε基因內(nèi)含子存在一4bp插入序列，該基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)無(wú)相關(guān)性。
　　 3、自然流產(chǎn)胚胎在本研究中未發(fā)現(xiàn)ε、ζ基因外顯子突變。
　　 4、母體外周血該ζ基因多態(tài)位點(diǎn)可否作為自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)篩查指標(biāo)之一，尚需大樣本研究