全基因組功能性非編碼RNA篩選系統(tǒng)的構(gòu)建與驗(yàn)證.pdf

1、隨著大規(guī)模高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNA）在疾病調(diào)控和發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用。目前，研究最多的功能ncRNA是發(fā)揮RNA干擾（RNA interference，RNAi）作用的microRNA和siRNA。但作為ncRNA家族中重要一員的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-codng RNA,LncRNA），不僅在數(shù)量上占全部ncRNA的近80%，而且可通過(guò)和靶

2、基因組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)節(jié)有機(jī)體的各種活動(dòng)，如轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后的表觀遺傳學(xué)修飾、控制細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等。LncRNA在基因組中廣泛存在，其表達(dá)水平的改變甚至是空間結(jié)構(gòu)變化都可引起一系列蛋白表達(dá)和信號(hào)通路狀態(tài)的變化。
　　以DNA為模版的RNA轉(zhuǎn)錄由三種不同的RNA聚合酶（RNA Pol I、II和III）完成。RNA Pol II能夠?qū)RNA和ncRNA轉(zhuǎn)錄，但RNA Pol I和RNA Pol III迄今

3、僅被發(fā)現(xiàn)可以轉(zhuǎn)錄ncRNA。本研究室在運(yùn)用兩個(gè)相向排列的RNA Pol III型啟動(dòng)子U6和 H1載體，成功構(gòu)建隨機(jī)siRNA干擾文庫(kù)的基礎(chǔ)上，遵循同樣的思路自行設(shè)計(jì)并建立了以人基因組 DNA衍生的ncRNA文庫(kù)。通過(guò)將被隨機(jī)打斷的人基因組DNA片段插入到雙啟動(dòng)子之間，成功構(gòu)建了能夠進(jìn)行全基因組篩選的ncRNA文庫(kù)。
　　為了確保文庫(kù)的構(gòu)建質(zhì)量，我們利用Gibson Assembly（GA）體外同源重組拼接技術(shù)，彌補(bǔ)了經(jīng)典分子克隆

4、方法在構(gòu)建文庫(kù)中的不足。該ncRNA質(zhì)粒文庫(kù)一次組裝數(shù)目約2.3×106，完成5次Gibson Assembly即可達(dá)到1.2×107的文庫(kù)庫(kù)容。隨機(jī)挑選8個(gè)陽(yáng)性克隆的菌落PCR和DNA測(cè)序分析證實(shí)了ncRNA文庫(kù)的多樣性和代表性。為了驗(yàn)證新構(gòu)建的ncRNA文庫(kù)的功能，我們嘗試?yán)胣cRNA文庫(kù)篩選人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中表達(dá)水平被特異性上調(diào)或下調(diào)后引起對(duì)維羅菲尼耐藥的基因。
　　我們發(fā)現(xiàn)親本A375對(duì)維羅菲尼的致死濃度為10μ

5、M。將ncRNA質(zhì)粒文庫(kù)包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫(kù)并感染親本A375細(xì)胞后，親本A375細(xì)胞接受致死濃度10μM維羅菲尼的篩選。早期，成功感染文庫(kù)的A375細(xì)胞大量死亡，但少部分存活細(xì)胞慢慢長(zhǎng)出一些集落，將這些篩選后存活的混合池細(xì)胞命名為A375/HL。我們發(fā)現(xiàn)和親本A375細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞A375/HL形態(tài)狹長(zhǎng)、呈梭形，呈間充質(zhì)樣形態(tài)改變；A375/HL細(xì)胞對(duì)維羅菲尼的敏感性降低。WST-1檢測(cè)顯示，親本A375對(duì)維羅菲尼的半數(shù)抑制濃度為

6、4.17μM，A375/HL對(duì)維羅菲尼的半數(shù)抑制濃度為8.76μM。在濃度為1μM的維羅菲尼作用下，A375/HL細(xì)胞的克隆形成能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于親本細(xì)胞A375。當(dāng)30μM高濃度的維羅菲尼處理A375/HL細(xì)胞24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞A375/HL組更容易形成藥物結(jié)晶，提示A375/HL可能比親本細(xì)胞的藥物泵出率高。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，和親本細(xì)胞A375相比，A375/HL細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin mRN

7、A的表達(dá)降低，其它相關(guān)的間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)升高。利用10條腫瘤相關(guān)信號(hào)通路熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，接受藥物處理后，A375/HL中沒(méi)有被激活的信號(hào)通路，包括Elk1/SRF、AP1、Myc/Max和STAT在內(nèi)的多條信號(hào)通路受到顯著抑制。據(jù)報(bào)道，BRAF抑制可導(dǎo)致其他信號(hào)通路的適應(yīng)性激活。接著我們檢測(cè)了EGFR信號(hào)通路中關(guān)鍵激酶Akt、STAT3、MEK和Erk的磷酸化水平。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)狀態(tài)下，p-Akt、p-S

8、TAT3、p-MEK和p-Erk在A375/HL細(xì)胞中的表達(dá)水平高于親本細(xì)胞A375，提示有包括EGFR信號(hào)通路在內(nèi)的其它信號(hào)通路的代償激活。
　　因此，我們認(rèn)為利用ncRNA文庫(kù)篩選出的對(duì)維羅菲尼耐藥的細(xì)胞與其它研究中描述的獲得性耐藥細(xì)胞以及臨床腫瘤耐藥樣本的耐藥特性有共通性。這表明我們利用基于人基因組DNA衍生的 ncRNA文庫(kù)進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)對(duì)維羅菲尼耐藥的功能基因篩選是有效可行的。最后，提取耐藥細(xì)胞A375/HL的基因組