傷寒沙門菌非編碼RNA AsrH驗(yàn)證與表型研究.pdf

1、目的：
　　近來，本研究組通過對(duì)傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi， S. Typhi）轉(zhuǎn)錄組的分析，新發(fā)現(xiàn)了很多非編碼RNA(non-coding RNA， ncRNA)，其中有一可能為rpoH基因?qū)?cè)編碼的ncRNA，稱為AsrH，本論文擬進(jìn)行AsrH表達(dá)鑒定和分子特性分析，觀察其在S. Typhi中的作用。
　　方法：
　　1.AsrH的鑒定：通過Northern Bl

2、ot證實(shí)AsrH在S. Typhi中的存在性，并通過Northern Blot和qRT-PCR觀察其生長時(shí)相的表達(dá)特性。
　　2.AsrH的分子全長鑒定：通過5′RACE、Tiling PCR來找出AsrH的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、可能的轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)，測(cè)出AsrH分子的大概全長。
　　3.基因缺陷變異株的制備：通過自殺質(zhì)粒pGMB151介導(dǎo)構(gòu)建S. Typhi asrH基因啟動(dòng)子缺陷變異株。
　　4. asrH變異株的半定量驗(yàn)證：用

3、RT-PCR分析S. Typhi野生株（簡(jiǎn)稱“WT”）和asrH變異株中asrH和rpoH的表達(dá)情況。
　　5.生長曲線測(cè)定：描制生長曲線，觀察WT、asrH基因啟動(dòng)子缺陷株在四種不同環(huán)境下（等滲、高滲應(yīng)激、氧應(yīng)激、酸應(yīng)激）時(shí)的生存情況。
　　6.動(dòng)力試驗(yàn)：半固體動(dòng)力培養(yǎng)板（0.3％）上培養(yǎng)細(xì)菌，觀察比較asrH啟動(dòng)子缺陷變異株、WT的動(dòng)力情況。
　　7.生物膜形成試驗(yàn)：生物膜結(jié)晶紫染色觀察asrH啟動(dòng)子缺陷變異株、W

4、T的生物膜形成情況。
　　結(jié)果：
　　1.Northern blot與qRT-PCR表明AsrH在S. Typhi中確實(shí)存在，而且在生長對(duì)數(shù)晚期（OD600＝1.2）的時(shí)候表達(dá)量最高。
　　2.經(jīng)過5′RACE和Tiling PCR分析，推斷AsrH分子全長在846bp-1007bp之間，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于rpoH基因終止碼下游119bp，轉(zhuǎn)錄方向相反，能覆蓋大部分的rpoH基因編碼區(qū)，中間沒有完整的ORF結(jié)構(gòu)，因此Asr

5、H為一長非編碼RNA。
　　3.自殺質(zhì)粒pGMB151介導(dǎo)敲制asrH基因啟動(dòng)子區(qū)域缺失120bp的變異株。
　　4.在asrH缺陷株中asrH基因不表達(dá)，rpoH基因正常表達(dá)。在WT中asrH和rpoH基因兩者都表達(dá)。
　　5.生長曲線顯示，在一定時(shí)間內(nèi)，與WT相比，酸、高滲應(yīng)激下asrH缺陷株的生存能力顯著降低，而在氧應(yīng)激下則相反。
　　6.動(dòng)力試驗(yàn)顯示，與WT相比，asrH啟動(dòng)子缺陷株的動(dòng)力幾乎完全喪失。7