傷寒沙門(mén)菌非編碼RNA AsrC的驗(yàn)證與特性研究.pdf

1、目的:
　　 非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)已經(jīng)成為核酸和蛋白質(zhì)之外參與基因表達(dá)調(diào)控的另一類(lèi)重要因子。本課題組通過(guò)對(duì)傷寒沙門(mén)菌（SalmonellaentericaserovarTyphi，S.Typhi）RNA序列分析和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了包括AsrC在內(nèi)的一些ncRNAs。本研究旨在對(duì)S.TyphincRNAAsrC進(jìn)一步鑒定，并研究其特性，以便對(duì)AsrC參與的基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行深入研究。
　　

2、 方法:
　　 1.AsrC的鑒定:利用NorthernBlot和qRT-PCR對(duì)AsrC進(jìn)行存在性、完整性驗(yàn)證，并觀察其生長(zhǎng)時(shí)相表達(dá)特性。
　　 2.AsrC的分子全長(zhǎng)鑒定:分別利用5′和3′RACE實(shí)驗(yàn)尋找AsrC的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)，以確定AsrC的分子全長(zhǎng)。
　　 3.AsrC在應(yīng)激條件下的表達(dá)量分析:利用NorthernBlot和qRT-PCR對(duì)傷寒沙門(mén)菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期，酸、氧及高滲環(huán)境應(yīng)激后As

3、rC的水平進(jìn)行分析。
　　 4.基因缺陷變異株的制備:利用λ-Red系統(tǒng)制備傷寒沙門(mén)菌asrC基因啟動(dòng)子缺陷變異株。
　　 5.基因缺陷回補(bǔ)株的制備:利用重組質(zhì)粒pBAD/gⅢ將lepA基因和pBAD/gⅢ空質(zhì)粒分別導(dǎo)入asrC基因啟動(dòng)子缺陷變異株，構(gòu)建lepA基因的缺陷回補(bǔ)株和lepA缺陷空質(zhì)粒對(duì)照株。
　　 6.asrC基因啟動(dòng)子缺失的定量分析:qRT-PCR分析S.Typhi野生株、asrC基因啟動(dòng)子缺陷株

4、中AsrC的水平。
　　 7.生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定:制作生長(zhǎng)曲線(xiàn)，觀察S.Typhi野生株、asrC基因啟動(dòng)子缺陷株、lepA基因缺陷回補(bǔ)株及空質(zhì)粒對(duì)照株在等滲、氧應(yīng)激、酸應(yīng)激和高滲應(yīng)激時(shí)的生長(zhǎng)狀況。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)NorthernBlot和qRT-PCR分析，確定AsrC存在表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期（OD6000.8）時(shí)AsrC的表達(dá)量最高。
　　 2.經(jīng)過(guò)5'和3'RACE實(shí)驗(yàn)鑒定AsrC的

5、分子全長(zhǎng)信息，并確定其分子全長(zhǎng)為893bp，與lepA基因部分重疊。
　　 3.NorthernBlot和qRT-PCR結(jié)果表明，S.TyphiAsrC在酸、氧及高滲應(yīng)激時(shí)的表達(dá)量均下降。
　　 4.利用λ-Red系統(tǒng)成功制備S.Typhi包含asrC基因啟動(dòng)子區(qū)域500bp的缺陷變異株。
　　 5.PCR及序列分析結(jié)果表明，成功構(gòu)建pBAD-lepA陽(yáng)性重組質(zhì)粒，并成功將重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒pBAD/gⅢ分別導(dǎo)入a

6、srC基因啟動(dòng)子基因缺失變異株中，成功制備lepA基因缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)粒對(duì)照株。
　　 6.qRT-PCR結(jié)果顯示，與S.Typhi野生株相比，asrC基因啟動(dòng)子缺失變異株中AsrC的水平顯著降低。
　　 7.生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，在氧應(yīng)激時(shí)asrC基因啟動(dòng)子缺失變異株生長(zhǎng)明顯比S.Typhi野生株慢(P＜0.05)，而lepA基因回補(bǔ)株及空質(zhì)粒株的生長(zhǎng)速度與野生株相似;在等滲條件、酸應(yīng)激和高滲應(yīng)激時(shí)，四種菌株的生長(zhǎng)狀況