基于組織表達(dá)譜的早期肺腺癌相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的篩選與驗(yàn)證.pdf

1、目的：原發(fā)性支氣管肺癌，簡(jiǎn)稱肺癌，可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。根據(jù)病理類型，非小細(xì)胞肺癌可分為腺癌、鱗癌、腺鱗癌和大細(xì)胞癌等。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA， lncRNA)、微小 RNA（microRNA，miRNA）和信使RNA（messengerRNA，mRNA）均為DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，lncRNA和miRNA可共同參與mRNA的表達(dá)。本研究擬將TNM分期I期肺腺癌（Lung adenocarnoma，

2、LUAD）腫瘤組織進(jìn)行RNA測(cè)序，篩選出異常表達(dá)的lncRNA、miRNA和mRNA，構(gòu)建三者的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，再進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能聚類分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路聚類分析，從而篩選出具有生物學(xué)功能的lncRNA。最后進(jìn)行基因表達(dá)水平的qRT-PCR驗(yàn)證，最終確定與LUAD相關(guān)的lncRNA。
　　

3、方法：本研究選取2015年12月29日至2016年2月18日在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院東院區(qū)胸外科行肺癌根治術(shù)的肺腺癌患者18例，TNM分期均為I期，術(shù)前均未接受放化療，術(shù)中采集其肺癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本。按照時(shí)間先后順序選取前10例進(jìn)行RNA高通量測(cè)序，后8例進(jìn)行RNA表達(dá)水平的qRT-PCR驗(yàn)證。lncRNA和mRNA部分：首先分別從癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本中提取總 RNA，去除 rRNA，然后將剩余的mRNA和lncRNA片段化，再

4、合成cDNA，最后應(yīng)用Illumina Hiseq4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。miRNA部分：在總RNA中回收長(zhǎng)度18-30 nt的RNA，通過(guò) RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，擴(kuò)增 cDNA，回收擴(kuò)增產(chǎn)物用于構(gòu)建小RNA文庫(kù)，最后應(yīng)用Illumina Hiseq2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。Illumina測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Base Calling軟件轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，即FastQ格式。用TopHat軟件將lncRNA和mRNA的純凈

5、序列與人類參考基因組Ensemble GRCh38 v84（hg19）進(jìn)行比對(duì)，將獲得的序列進(jìn)行拼接并獲得lncRNA和mRNA在人參考基因組Ensemble GRCh38 v84中的位置。應(yīng)用Bowtie軟件將miRNA與hg19進(jìn)行比對(duì)。應(yīng)用Cuffdiff程序篩選出與相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織相比在癌組織中差異表達(dá)的lncRNA（Differentially Expressed lncRNA，DEL）和差異表達(dá)的mRNA（Differe

6、ntially Expressed mRNA，DEM）。使用 DEGseq程序選出癌組織中差異表達(dá)的miRNA（Differentially Expressed microRNA，DEMI）。應(yīng)用miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEMI的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，構(gòu)建DEMI-DEM交互網(wǎng)絡(luò)，分析DEMI和DEM之間的相互作用關(guān)系，此過(guò)程通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行分析并展示。計(jì)算DEL和 DEM的表達(dá)水平之間的共表達(dá)相關(guān)性的Pearson相關(guān)系數(shù)（Pe

7、arson correlation coefficients，PCCs）。|PCC≥0.90|的DEL-DEM共表達(dá)對(duì)用來(lái)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。在GRCH38參考基因組中篩選出DEL附近的蛋白質(zhì)編碼基因，這些編碼基因與LUAD中的DEM比對(duì)，并篩選出LUAD中DEL附近的DEM。然后，將DEL附近的DEM與DEMI負(fù)性調(diào)控的那些DEM取交集，由此構(gòu)建DEL-DEMI-DEM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，由Cytoscape分析并呈現(xiàn)。然后進(jìn)行GO分析和KEGG

8、分析，以探究癌組織中DEL的潛在的生物學(xué)功能。最后，進(jìn)行 DEL/DEMI/DEM的表達(dá)水平 qRT-PCR驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1.本研究確定15710個(gè)lncRNA和22528個(gè)mRNA在人參考基因組Ensemble GRCh38 v84中的位置。與相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織相比在癌組織總共鑒定出了175個(gè)差異表達(dá)的lncRNA（DEL，63個(gè)上調(diào)和112個(gè)下調(diào)）和1321個(gè)差異表達(dá)的mRNA（DEM，587個(gè)上調(diào)和734個(gè)

9、下調(diào)）。在肺癌組織中LOC80078和LOC101930114是最顯著的上調(diào)和下調(diào)的DEL；EEF1A2和ANKRD1是最顯著的上調(diào)和下調(diào)的DEM。與相對(duì)應(yīng)的癌旁組織相比在癌組織中篩選出了94個(gè)DEMI，包括87個(gè)上調(diào)的DEMI和7個(gè)下調(diào)的DEMI。其中hsa-miR-194-5p、hsa-miR-135b-5p和hsa-miR-215-3p在癌組織中顯著上調(diào)；hsa-miR-486-5p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-

10、7641、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-486-3p和hsa-miR-139-3p在癌組織中顯著下調(diào)。
　　2.通過(guò)miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了癌組織中前15個(gè)上調(diào)和下調(diào)的DEMI的靶基因，這些靶基因與1321個(gè)DEM重疊。通過(guò)Cytoscape分析并呈現(xiàn)的DEMI-DEM相互作用網(wǎng)由534個(gè)節(jié)點(diǎn)和1123個(gè)邊組成，其中上調(diào)的DEMI與下調(diào)的DEM相互作用網(wǎng)絡(luò)由395個(gè)節(jié)點(diǎn)和942個(gè)邊組成，

11、其涉及15個(gè)上調(diào)的DEMI和384個(gè)下調(diào)的DEM；hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-429與下調(diào)的DEM關(guān)聯(lián)性最高，分別與99、83和82個(gè)DEM相互作用。下調(diào)DEM/上調(diào)DEM由139個(gè)節(jié)點(diǎn)和181個(gè)邊組成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，其涉及7個(gè)下調(diào)的DEMI和132個(gè)上調(diào)的DEM；hsa-miR-486-3p、hsa-miR-138-5p和hsa-miR-338-3p與上調(diào)的DEM關(guān)聯(lián)性最高，分別與61、45

12、和41個(gè)下調(diào)的DEM相互作用。
　　3.在 GRCH38參考基因組中篩選出了距離175個(gè) DEL分別<100kb的蛋白質(zhì)編碼基因，共篩選出了190個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。在癌組織中這190個(gè)基因與1321個(gè)DEM重疊，發(fā)現(xiàn)位于38個(gè)DEL附近的42個(gè)DEM是可用的。在 DEL-DEM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，CDKN2B-AS1、FENDRR和LINC00312與DEM具有高度關(guān)聯(lián)性，其分別與105、63和61個(gè)DEM共表達(dá)。DEL-DEMI-DE

13、M共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)揭示了上述DEL，DEMI和DEM之間的聯(lián)系。KEGG分析顯示DEM在細(xì)胞粘附分子、粘著斑和緊密連接富集；GO分析顯示DEM在細(xì)胞粘附、血管生成、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)等顯著富集。
　　4.qRT-PCR驗(yàn)證8例I期LUAD患者癌組織和8例相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中的DEL/DEMI/DEM。和對(duì)照組相比，在癌組織中hsa-miR-200a-3p(P<0.01)、hsa-miR-200b-3p(P<0.05)、hsa-miR-200

14、b-5p(P<0.05)、hsa-miR-200c-5p(P<0.05)和 hsa-miR-429(P<0.01)表現(xiàn)為上調(diào)， hsa-miR-338-3p(P<0.05)表現(xiàn)為下調(diào)；ADARB1（P<0.01），ADRB2（P<0.05）和ANKRD1（P<0.05）的表達(dá)水平顯著下調(diào)；COL1A1（P<0.05）和MMP13（P<0.05）顯著上調(diào)（圖5G-5K）；lncRNA FENDRR（P<0.01）和LINC00312（P<

15、0.01）的表達(dá)水平顯著下調(diào)，lncRNA CDKN2B-AS1具有上調(diào)趨勢(shì)。
　　結(jié)論：本研究以TNM分期I期肺腺癌為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行RNA測(cè)序，獲得異常表達(dá)的RNA。研究表明lncRNA FENDRR、LINC00162、LINC00515和 LINC00312在早期肺腺癌中表達(dá)下調(diào)；CDKN2B-AS1在早期肺腺癌中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系，這可能對(duì)肺腺癌具有早期診斷價(jià)值。我