噪聲習(xí)服對(duì)豚鼠的聽力保護(hù)及miRNA183在其中的作用.pdf

1、目的:噪聲危害已經(jīng)成為當(dāng)今世界各國(guó)主要的職業(yè)危害之一。噪聲習(xí)服，即為在相對(duì)較低強(qiáng)度的噪聲中進(jìn)行訓(xùn)練，從而使機(jī)體逐漸適應(yīng)的過程，其目的是在機(jī)體本身不產(chǎn)生永久性聽力閾移(permanentthreshold shift，PTS)的基礎(chǔ)上，給予適度的刺激，以獲得對(duì)隨后高強(qiáng)度噪聲更大的耐受力，從而起到保護(hù)聽力的作用。噪聲習(xí)服作為強(qiáng)噪聲暴露的一種可能的保護(hù)行為，其發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。近些年隨著人類后基因組計(jì)劃的進(jìn)一步開展，miRNAs越來(lái)越受

2、到人們關(guān)注。已有研究表明miR-183可以通過抑制Taok1保護(hù)強(qiáng)刺激后的耳蝸損傷。本研究探討噪聲習(xí)服對(duì)豚鼠耳蝸內(nèi)miRNA-183表達(dá)的影響，及其在習(xí)服保護(hù)過程中可能的作用機(jī)制。
　　方法:40只雄性豚鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NG組），噪聲習(xí)服組（CG組），噪聲習(xí)服+強(qiáng)噪聲暴露組（CHG組），單純強(qiáng)噪聲暴露組（HG組）。NG組的動(dòng)物放在本底噪聲小于35dB的室內(nèi)。噪聲暴露在混響室內(nèi)進(jìn)行，將豚鼠編號(hào)，單只固定在特制的鐵絲籠中，揚(yáng)聲器

3、置于動(dòng)物頭部正上方。噪聲暴露系統(tǒng)由信號(hào)發(fā)生器、功率放大器和揚(yáng)聲器組成。動(dòng)態(tài)信號(hào)分析儀產(chǎn)生噪聲信號(hào)，經(jīng)功率放大器放大后，輸入揚(yáng)聲器。經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料并結(jié)合既往的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，最終確定習(xí)服暴露條件:倍頻程噪聲（中心頻率為1000Hz），噪聲強(qiáng)度為(90±1)分貝聲壓級(jí)，連續(xù)7天，以每天6小時(shí)的方式暴露。CHG組進(jìn)行噪聲習(xí)服之后，休息2天，與HG組一起接受高強(qiáng)度噪聲暴露，噪聲的頻譜同習(xí)服暴露，暴露強(qiáng)度(112±1)dB SPL，連續(xù)暴露4h。

4、暴露前信號(hào)發(fā)生器、功率放大器及揚(yáng)聲器需開機(jī)預(yù)熱10分鐘。每次試驗(yàn)前及間隔1小時(shí)采用聲級(jí)計(jì)對(duì)噪聲強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。采用腦干誘發(fā)電位反應(yīng)閾(auditory brainstem response，ABR)測(cè)量各組動(dòng)物聽力閾移。以ABR閾值代表動(dòng)物的聽力閾值。暴露前測(cè)定每只動(dòng)物的基礎(chǔ)ABR，暴露后測(cè)定閾值并計(jì)算聽力閾移。將清醒狀態(tài)下的動(dòng)物，于測(cè)聽臺(tái)上牢固固定，并將其與測(cè)聽臺(tái)一起共同放入隔聲屏蔽箱內(nèi)，豚鼠外耳道口到耳機(jī)膜片之間的距離為3cm。采用針

5、電極測(cè)定。刺激聲為click短聲，測(cè)量從高聲強(qiáng)開始（一般為90分貝），以20分貝、10分貝、5分貝依次逐漸衰減，直到出現(xiàn)具有可辨圖形的最低聲音強(qiáng)度，以此做為其ABR閾值，閾值強(qiáng)度要重復(fù)檢測(cè)一次。動(dòng)物斷頭處死后取雙側(cè)耳蝸組織，右耳蝸放入0.5％的硝酸銀(AgNO3)溶液中染色、4％多聚甲醛(PFA)固定、暴光顯色、剝離鋪片、觀察計(jì)數(shù)、鋪片照相測(cè)定各組外毛細(xì)胞缺失率。將保存于液氮中的左側(cè)耳蝸組織搗碎，用Trizol提取總RNA，整個(gè)過程在無(wú)

6、RNA酶的環(huán)境下操作，對(duì)提取物進(jìn)行分光光度計(jì)及變性凝膠測(cè)定。應(yīng)用miR-183反轉(zhuǎn)引物，將提取的總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。將反轉(zhuǎn)產(chǎn)物(cDNA)作為模板，利用miR-183擴(kuò)增引物，采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timequantitative PCR，qRT-PCR)方法檢測(cè)各組豚鼠耳蝸中miR-183的表達(dá)水平，所有樣本重復(fù)3孔，以U6分子作為內(nèi)參基因。ΔCt=CtmiR-183—CtU6， miRNA183的表達(dá)量用2-ΔCt表示。

7、用此公式計(jì)算的先決條件是PCR的擴(kuò)增效率必須大于90％。PCR效率可由標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率得到。輸入待測(cè)基因(miR-183)和參照基因(U6) cDNA以及其10倍梯度稀釋的濃度值后，系統(tǒng)將會(huì)自動(dòng)給出分別針對(duì)待測(cè)基因miRNA183和參照基因U6的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及線性回歸斜率（此斜率可以代表PCR的效率）。
　　結(jié)果:1.噪聲習(xí)服對(duì)聽閾的影響。習(xí)服暴露過程中每天的閾移逐漸減少，顯示了噪聲習(xí)服的有效作用。對(duì)各實(shí)驗(yàn)組因損傷暴露引起的聽力損傷的

8、監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，CG組聽力閾移較小，平均(8.7±1.4)dB，即聽力損傷較輕;HG組聽力閾移最大，為（42.8±9.2）dB; CHG組的聽力閾移為(29.3±6.4) dB，明顯小于HG組，兩組比較差別非常顯著(P＜0.01)。2.豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)以及各圈外毛細(xì)胞的缺失率，在噪聲習(xí)服條件下的變化。在光學(xué)顯微鏡下，豚鼠耳蝸基底膜鋪片可見:正常豚鼠，耳蝸基底膜的外毛細(xì)胞有少量自然缺失，缺失趨勢(shì)在Ⅰ至Ⅲ圈逐漸增多。噪聲暴露后豚鼠，

9、耳蝸外毛細(xì)胞出現(xiàn)纖毛損傷，表現(xiàn)為:缺失增多的靜纖毛，排列出現(xiàn)散亂、融合和退行性變。其中缺失最為嚴(yán)重的是強(qiáng)噪聲暴露組。外毛細(xì)胞缺失主要發(fā)生在耳蝸第Ⅱ、Ⅲ圈基底膜。IHC未發(fā)現(xiàn)明顯損傷。外毛細(xì)胞的損傷在CG組（％，T1:0.89±0.18、T2:2.08±0.44、T3:2.26±0.84）較NG組(％,T1:0.64±0.16、T2:1.64±0.34、T3:1.81±0.38)稍微嚴(yán)重，但差異無(wú)顯著性。HG組（％，T1:4.01±0.8

10、4、T2:6.78±1.18、T3.8.94±1.89）和CHG組（％，T1:1.24±0.21、T2:4.68±0.67、T3:6.81±0.98）與NG組相比外毛細(xì)胞缺失在Ⅰ至Ⅲ圈均具有非常顯著差別（P＜0.05）。CHG組與HG組相比，外毛細(xì)胞缺失在Ⅰ至Ⅲ圈均有顯著差別（P＜0.05），提示噪聲習(xí)服暴露可減少其后強(qiáng)噪聲損傷暴露引起的外毛細(xì)胞缺失。3.各組豚鼠耳蝸中miR-183的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CG組miR-183的表達(dá)量（1

11、3.04±0.86）較NG組（6.19±0.88）升高，差別顯著（P＜0.05）;CHG組miR-183的表達(dá)量（4.13±0.66）較NG組降低，差別顯著（P＜0.05）;HG組miR-183的表達(dá)量（1.55±0.21）較NG組降低，差別顯著（P＜0.05）;HG組miR-183的表達(dá)量較CHG組降低，差別顯著(P＜0.05)。研究結(jié)果提示噪聲習(xí)服能夠促進(jìn)耳蝸組織的miR-183的表達(dá)，強(qiáng)噪聲損傷能夠降低miR-183的表達(dá)。外毛細(xì)

12、胞的損傷在NG組和CG組無(wú)明顯差異，但miR-183在CG組較NG組明顯增高，而且隨著外毛細(xì)胞損傷程度的加重，miR-183的表達(dá)降低。
　　結(jié)論:一定強(qiáng)度噪聲習(xí)服暴露可使耳蝸毛細(xì)胞產(chǎn)生某些變化，使其在之后的噪聲暴露中損傷減輕，起到保護(hù)聽力的作用;這種保護(hù)作用可能是由于噪聲習(xí)服誘導(dǎo)耳蝸中miR-183的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，高表達(dá)的miR-183可能通過負(fù)調(diào)控其下游靶基因，抑制毛細(xì)胞的損傷和缺失，從而產(chǎn)生聽力保護(hù)作用。因此考慮習(xí)服過程所產(chǎn)生