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文檔簡(jiǎn)介
1、能量代謝重編碼是腫瘤的第九大特征,限制葡萄糖供應(yīng)的饑餓療法可能是一種安全、有效的治療方法。然而,葡萄糖饑餓對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響及相關(guān)分子機(jī)制目前仍不清楚。本研究采用低糖(LG)和對(duì)照高糖(Control)培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細(xì)胞,通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低糖對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響;再用shRNA干擾HSF1以及HSF l-shRES基因回補(bǔ)策略,分析HSF1在LG影響肝癌細(xì)胞遷移能力中的作用;最后通過(guò)生物信息學(xué)分析、
2、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(CHIP)以及熒光素酶報(bào)道基因活性測(cè)定進(jìn)一步探討相關(guān)的分子機(jī)制,為肝癌治療提供新的策略。
第一部分低糖對(duì)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及遷移能力的影響
TGF-β1是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的有力誘導(dǎo)劑,經(jīng)5ng/mL TGF-β1處理肝癌細(xì)胞48h后,Control組肝癌細(xì)胞出現(xiàn)典型EMT樣形態(tài)學(xué)變化,細(xì)胞由多邊形向成纖維樣細(xì)胞形態(tài)改變,而LG組無(wú)顯著變化。熒光定量PCR和蛋白印跡方法檢測(cè)EMT相
3、關(guān)的標(biāo)志物表達(dá)情況,Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力的改變。結(jié)果顯示,培養(yǎng)細(xì)胞48h后,LG組N-cadherin的表達(dá)水平較Control組明顯降低,而E-cadherin的表達(dá)水平較Control組顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)細(xì)胞30h后LG組穿膜的細(xì)胞數(shù)較Control組明顯減少,差異有顯著性。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示與Control組相比LG組劃痕的愈合速度明顯減慢,且LG組劃痕邊
4、緣的細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣,而Control組劃痕邊緣的細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣。本部分研究表明LG抑制肝癌細(xì)胞的EMT樣形態(tài)學(xué)改變,抑制其“鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)換”及遷移能力。
第二部分 HSF1在低糖抑制肝癌細(xì)胞EMT及遷移能力中的作用
HSF1是一個(gè)具有促癌作用的多功能轉(zhuǎn)錄因子,參與腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝,并促進(jìn)惡性表型和轉(zhuǎn)移。熒光定量PCR和蛋白印跡顯示LG培養(yǎng)持續(xù)下調(diào)HSF1的表達(dá),推測(cè)HSF1可能參與葡萄糖饑餓對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表
5、型的影響。為了確認(rèn)HSF1是否在低糖條件下肝癌細(xì)胞EMT及相關(guān)遷移中發(fā)揮作用,構(gòu)建了shHSF1、對(duì)照shNT以及HSF1基因回補(bǔ)(shRES),并采用熒光定量PCR和蛋白印跡加以驗(yàn)證。熒光定量PCR和蛋白印跡結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染shHSF1之后,HSF1表達(dá)水平顯著降低,說(shuō)明HSF1基因干擾可信;shRES組HSF1表達(dá)水平較shHSF1組回升,說(shuō)明HSF1基因回補(bǔ)策略可抵消干擾作用。此外,通過(guò)Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞處理前后肝
6、癌細(xì)胞遷移能力的改變。Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示,與高糖培養(yǎng)相比,低糖培養(yǎng)時(shí)Control組和shNT組穿膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少。然而,LG培養(yǎng)條件下,shHSF1組穿膜的細(xì)胞數(shù)較Control組和shNT組顯著增加。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Transwell一致,LG培養(yǎng)條件下,shHSF1組劃痕的愈合速度明顯快于Control和shNT組。本部分研究結(jié)果表明,HSF1促進(jìn)低糖對(duì)肝癌細(xì)胞EMT及遷移能力的抑制作用。
第三部分 HSF1
7、在低糖抑制肝癌細(xì)胞EMT及遷移能力中的作用機(jī)制
Snail是EMT過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)TRED數(shù)據(jù)庫(kù)和啟動(dòng)子預(yù)測(cè)服務(wù)器2.0組合,發(fā)現(xiàn)Snail基因的啟動(dòng)子序列位于上游的-700bp~299bp。此外,應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(Transcription Factors Database)對(duì)人Snail基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Snail啟動(dòng)子區(qū)域存在熱休克元件(HSE)核心序列5'-nGAAn-3'結(jié)合位點(diǎn)。提示Snail可
8、能是HSF1下游的靶標(biāo)分子,HSF1可能通過(guò)直接調(diào)控Snail的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)節(jié)Snail的表達(dá)。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(CHIP)和熒光素酶報(bào)道基因活性測(cè)定加以驗(yàn)證,結(jié)果顯示:與Control組相比,LG組的相對(duì)熒光素酶活性明顯增強(qiáng),而且LG組特異性HSF1抗體結(jié)合的DNA產(chǎn)物量明顯高于Control組,差異具有顯著性。結(jié)果表明LG培養(yǎng)條件下HSF1能與Snail啟動(dòng)子結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)其表達(dá);而Control培養(yǎng)下HSF1與Snai
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