黃連素經(jīng)由PI3K通過調(diào)控MMP3和MMP9的表達(dá)抑制肺炎衣原體感染誘導(dǎo)的VSMC遷移.pdf

1、研究目的：
　　 利用肺炎衣原（Chlamydia pneumoniae，C.pn）體外感染大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)模型，觀察基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)在C.pn感染誘導(dǎo)VSMC遷移過程中的作用;觀察黃連素對(duì)C.pn感染誘導(dǎo)VSMC遷移的干預(yù)作用，并探討其相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 內(nèi)容和方法：
　　

2、1.C.pn增殖培養(yǎng)后體外感染大鼠原代VSMC;
　　 2.MMPs廣譜抑制劑GM6001抑制MMPs后，Wound-healing實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察MMPs在C.pn感染誘導(dǎo)VSMC遷移中的作用;
　　 3.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)C.pn感染后VSMC內(nèi)MMPs mRNA的表達(dá)水平;
　　 4.明膠

3、酶譜法檢測(cè)C.pn感染VSMC后MMP9酶活性的變化;
　　 5.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測(cè)C.pn感染VSMC后MMP3和MMP9蛋白的表達(dá)水平;
　　 6.PI3K特異性抑制劑LY294002抑制PI3K的活性后，明膠酶譜法和ELISA分別檢測(cè)各組VSMC MMP9酶活性及MMP3和MMP9蛋白表達(dá)水平的變化;
　　 7.利用CC

4、K-8實(shí)驗(yàn)觀察黃連素對(duì)VSMC活力的影響;
　　 8.不同濃度黃連素干預(yù)C.pn感染的VSMC后，Wound-healing和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察黃連素對(duì)C.pn感染誘導(dǎo)的VSMC遷移能力的影響;運(yùn)用明膠酶譜法和ELISA分別檢測(cè)各組VSMC MMP9酶活性水平及MMP3和MMP9蛋白表達(dá)水平的變化;
　　 9.黃連素干預(yù)C.pn感染的VSMC后，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C.pn感染后VSMCAkt磷酸化水平的變化。

5、r>　　 結(jié)果：
　　 1.Wound-healing實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VSMC24 h后，感染組細(xì)胞向劃痕中央遷移的面積明顯大于正常對(duì)照組(P＜0.05);GM6001預(yù)處理VSMC后C.pn感染誘導(dǎo)的VSMC向劃痕中央遷移的面積明顯低于單純C.pn感染組（P＜0.05)。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VSMC24 h后穿越Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05);GM6001預(yù)處理后C.pn感染

6、的VSMC穿越Matrigel膠的數(shù)目明顯低于單純C.pn感染組(P＜0.05)。
　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示，MMP1和MMP2 mRNA的表達(dá)水平在C.pn感染VSMC后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化(P＞0.05);而MMP3 mRNA的表達(dá)水平則從C.pn感染后4h開始升高，18h達(dá)到峰值，并持續(xù)至72 h(P＜0.05);MMP9 mRNA的表達(dá)水平從感染后18h開始升高，36h達(dá)到峰值，持續(xù)至72 h(P＜0.05)。

7、
　　 3.明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MMP9酶活性在C.pn感染后6h開始升高，并隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)其活性逐漸增高，至72 h達(dá)到最高;且在所觀察的時(shí)間段內(nèi)，MMP9的酶活性與C.pn感染VSMC的時(shí)間呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.9829，P＜0.05)。用LY294002抑制PI3K活性后，C.pn感染的VSMC MMP9的酶活性較單純C.pn感染組明顯降低(P＜0.05)。
　　 4.ELISA結(jié)果顯示，MMP3的蛋白表

8、達(dá)在C.pn感染后12h開始升高，24 h升高最明顯(P＜0.05)，并持續(xù)至72 h。MMP9的蛋白表達(dá)在C.pn感染后24 h開始升高，至72 h達(dá)到最高(P＜0.05)。用LY294002抑制PI3K活性后，在C.pn感染的VSMC內(nèi)MMP3和MMP9的蛋白表達(dá)明顯低于單純C.pn感染組（P＜0.05）。
　　 5.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連素濃度在低于100μM時(shí)，VSMC的活力和正常對(duì)照組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義;而黃連素濃度高于100μM時(shí)，VSMC的活力較正常對(duì)照組明顯減弱(P＜0.05)，且濃度越高，細(xì)胞活力減弱越明顯，即150μM時(shí)VSMC的活力下降到正常VSMC活力的63％;200μM和300μM時(shí)，VSMC的活力分別下降到正常VSMC活力的47％和19％
　　 6.Wound-healing實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度黃連素干預(yù)C.pn感染的VSMC后，各組細(xì)胞向劃痕中央遷移的面積較單純C.pn感染組均明顯減小(P＜0.05)

10、，且細(xì)胞遷移的面積隨黃連素濃度的升高而逐漸減小。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VSMC后，黃連素各組穿Matrigel的VSMC數(shù)較單純C.pn感染組均降低(P＜0.05);且隨著黃連素濃度增加穿膜細(xì)胞數(shù)逐漸減少。
　　 7.明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，C.pn感染VSMC36 h后，MMP9的酶活性明顯升高(P＜0.05);與單純C.pn感染組相比，經(jīng)黃連素干預(yù)的C.pn感染的VSMC MMP9的活性明顯減弱(P＜

11、0.05);且黃連素的濃度越高，MMP9的酶活性減弱越明顯。ELISA結(jié)果也顯示，黃連素干預(yù)的C.pn感染的 VSMC MMP3和MMP9的表達(dá)水平較單純C.pn感染組均明顯下降(P＜0.05);且黃連素的濃度越高，MMP3和MMP9的表達(dá)水平越低。
　　 8.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組VSMC中總Akt和β-actin的表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C.pn感染組VSMC p-Akt的表達(dá)水平較正常對(duì)照