TLR2在肺炎衣原體感染誘導(dǎo)血管平?jīng)]肌細(xì)胞遷移中的作用.pdf

1、目的：建立肺炎衣原體(Chlamdia pneumoniae，C.pn)體外感染大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)模型；觀察C.pn感染對(duì)VSMC遷移能力的影響以及Toll樣受體2(Toll Like Receptor2，TLR2)在C.pn感染促進(jìn)VSMC遷移中的作用，探討其相關(guān)分子機(jī)制。
　　 方法：⑴取清潔級(jí)SD大鼠主動(dòng)脈中層，用組織貼塊法對(duì)VSMC進(jìn)行原代培養(yǎng)。倒置顯微

2、鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，用特異性小鼠抗人單克隆a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscle actin，a-SM actin)抗體對(duì)VSMC進(jìn)行鑒定；⑵C.pn AR-39株在人喉癌細(xì)胞系(Human Epidermoid Carcinoma-2 cell，HEp-2細(xì)胞)內(nèi)增殖培養(yǎng)后感染VSMC；⑶確定C.pn成功感染VSMC：C.pn感染72 h后，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction，PCR)檢測(cè)C.pn

3、特異性DNA片段；盧戈氏碘染色和吖啶橙(acridineorange，AO)染色，觀察VSMC感染狀態(tài)和C.pn包涵體的形態(tài)特點(diǎn)；利用小鼠抗C.pn單克隆抗體確定C.pn成功感染VSMC；⑷透射電鏡下觀察感染24h、48 h和72h后，VSMC內(nèi)C.pn的增殖情況和細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化；⑸Wound-healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察C.pn感染24h后的VSMC遷移能力的變化；⑹逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse tran

4、scription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)C.pn感染后不同時(shí)間點(diǎn)TLR2和TLR4 mRNA的表達(dá)水平；⑺用小鼠抗C.pn單克隆抗體和兔抗大鼠TLR2抗體進(jìn)行熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察感染后C.pn與TLR2在VSMC內(nèi)的位置關(guān)系；⑻用TLR2阻斷劑阻斷TLR2的作用，RT-PCR檢測(cè)各組髓樣分化蛋白88(Myeloid differentiation protein88，MyD88)m

5、RNA表達(dá)水平以檢測(cè)TLR2阻斷劑的效能；⑼Wound-healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察TLR2在C.pn感染促進(jìn)VSMC遷移中的作用。
　　 結(jié)果：①原代培養(yǎng)的VSMC光鏡下觀察呈“峰與谷”樣生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多呈寬大的長(zhǎng)梭形，核大。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示VSMC a-SM actin呈陽性，呈現(xiàn)束狀肌絲特征；②PCR在感染的VSMC內(nèi)檢測(cè)到437 bp的C.pn特異性DNA片段；盧戈氏碘染色可見C.pn包涵體呈紅棕色

6、或紅褐色；AO染色和免疫熒光染色法觀察到C.pn感染后在VSMC內(nèi)以包涵體和點(diǎn)狀感染灶兩種形態(tài)存在，包涵體的體積比點(diǎn)狀感染灶大，但量相對(duì)較少，提示C.pn感染VSMC模型成功建立；③透射電鏡下可見，C.pn感染24h后，VSMC內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)體積較小的包涵體；感染48 h后，包涵體內(nèi)出現(xiàn)含致密核結(jié)構(gòu)的原體(elementary body，EB)及呈膜泡樣的網(wǎng)狀體(reticulate body，RB)等C.pn特征性超微結(jié)構(gòu)；感染72h后，

7、包涵體內(nèi)RB和EB數(shù)量明顯增多，成熟EB比例顯著增大。細(xì)胞在C.pn感染后不同時(shí)間段出現(xiàn)相應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)改變；④Wound-healing實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VSMC24 h后，細(xì)胞向劃痕中央遷移的距離明顯大于正常對(duì)照組(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C.pn感染VSMC24 h后，C.pn感染組的細(xì)胞遷移數(shù)明顯多于正常對(duì)照組(P<0.01)；⑤RT-PCR結(jié)果顯示，C.pn感染VSMC后TLR2被激活，其表達(dá)量迅

8、速升高，在感染后8 h即可達(dá)到高峰，并持續(xù)至24 h，其相對(duì)表達(dá)量高于TLR4；⑥共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)C.pn感染后，TLR2表達(dá)位點(diǎn)發(fā)生變化，主要聚集于包涵體周圍；⑦TLR2阻斷劑阻斷TLR2的作用后，C.pn感染引起的MyD88 mRNA表達(dá)增強(qiáng)可被明顯抑制(P<0.01)；⑧Wound-healing實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，C.pn感染24 h后的VSMC遷移能力明顯強(qiáng)于TLR2阻斷劑預(yù)處理的C.pn感染組細(xì)胞(P