CK2介導NR2B磷酸化在異氟烷對發(fā)育期神經(jīng)元毒性損傷中的機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　發(fā)育期神經(jīng)元處于興奮與抑制的不平衡狀態(tài)。在發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)，GABA作為一種興奮性神經(jīng)遞質在發(fā)育期神經(jīng)元生長及突觸形成中發(fā)揮著重要的作用。在這種缺乏抑制性神經(jīng)遞質的狀態(tài)下，并沒有導致發(fā)育期神經(jīng)元產生病理性改變，相反可以促進發(fā)育期神經(jīng)元生長及可塑性，究其原因可能與NMDA受體的發(fā)育期特點有關。
　　在海馬所在的前腦區(qū), NMDA受體 NR2A/NR2B比例會隨個體發(fā)育而升高,而 LTP和LTD誘導的難易程度

2、也隨之發(fā)生變化,提示了NR2A/NR2B比例可能影響腦的發(fā)育和突觸可塑性的形成。NMDA受體亞單位隨著神經(jīng)元發(fā)育及活動依賴性轉變。研究表明NMDA受體亞單位從發(fā)育期NR2B到成熟期NR2A轉變受到PKA、PKC、及CK2等激酶的調節(jié)。NR2B受體是防止發(fā)育期神經(jīng)元過度興奮性損傷的天然屏障。在發(fā)育期神經(jīng)元，突觸后膜主要表達NR2B受體。出生后，隨著神經(jīng)元的發(fā)育生長，NR2B受體逐漸被NR2A受體取代。通過磷酸化NR2B受體，導致NR2B受

3、體胞吞和NR2A受體插入突觸后膜，突觸發(fā)育成熟。
　　Cdk5的調節(jié)激動劑 p35，是一種大腦特異性的鈣蛋白酶作用底物，Cdk5和 p35都是維持大腦發(fā)育和存活的重要通道蛋白。谷氨酸鹽激活原代神經(jīng)元中的NMDAR，可以激發(fā)鈣依賴性-鈣蛋白酶介導的p35蛋白水解為更小分子量的p25,部分程度上因為Cdk5的異常激活和靶向重置而誘導神經(jīng)元凋亡。因此，在這些神經(jīng)元中，抑制鈣蛋白酶或Cdk5可以阻止p25介導的神經(jīng)元損傷。需要指出的是，經(jīng)

4、歷某些形式的非興奮毒性損傷的神經(jīng)元同樣需要鈣蛋白酶介導產生的p25，提示鈣蛋白酶抑制劑的治療潛力不僅局限于神經(jīng)元興奮毒性損傷。與其在興奮毒性中的重要角色相一致的是，在局部缺血性腦卒中和全大腦缺血的小鼠模型的大腦中，以及阿爾茨海默病患者和缺血性中風患者腦組織樣本中，p25表達是增加的。重要的是，轉基因小鼠前腦中p25的過表達會觸發(fā)神經(jīng)退行性變，抑制Cdk5或它的下游目標基因，可以阻止由p25和腦缺血引起的神經(jīng)元損傷。盡管有很多蛋白是Cdk

5、5的磷酸化底物，p25誘導的神經(jīng)元損傷被證明是由Cdk5介導的NMDAR的GluN2A亞單位磷酸化、肌細胞增強因子2和抗氧化劑酶Prx2和無嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶的磷酸化和抑制以及組蛋白脫乙酰酶的抑制所引起。
　　本實驗室最近研究證實吸入麻醉藥劑量依賴性易化發(fā)育期神經(jīng)元電壓依賴性鈣通道（Voltage dependent calcium channels，VDCC）和 N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic

6、 acid，NMDA)受體，增加神經(jīng)元內自由鈣離子濃度，導致明顯的毒性反應。對吸入性全身麻醉藥致發(fā)育神經(jīng)元突觸可塑性及其機制進行深入研究，并探索有效的防治手段，對指導臨床安全使用吸入性全身麻醉藥顯得尤其重要。本實驗擬證實以下幾個假設：
　　1.異氟烷通過改變NMDAR磷酸化程度和其亞型比例，影響發(fā)育期神經(jīng)元形態(tài)和功能。
　　2.異氟烷通過CK2-CDK5-p35通路影響NMDAR受體構成及功能。
　　3.臨床相關濃度異

7、氟烷對發(fā)育期大鼠遠期學習記憶功能并無顯著影響。
　　研究方法和結果：
　　1.測定吸入異氟烷前后海馬神經(jīng)元NMDA受體亞單位表達的變化
　　選擇同窩出生5天SD大鼠，隨機分組，處理組在相同條件下分別吸入相同濃度異氟烷（MAC1.3）2、4、6小時，對照組吸入空氣，24小時之后處死大鼠并分離海馬組織。利用Western Blot方法，檢測吸入麻醉藥干預前后海馬神經(jīng)元NR2A和NR2B蛋白表達變化及S1480位點磷酸化程度

8、的改變。
　　結果：臨床相關濃度異氟烷（Mac1.3）呈劑量依賴性降低NR2B的Ser1480位點磷酸化，減少細胞膜上的NR2B表達（P<0.05），而NR2B總表達量和NR2A表達無顯著變化。異氟烷吸入4小時組海馬神經(jīng)元的NR2B-PSD95復合物比對照組顯著減少（P<0.05）。這也證明了NR2B的Ser1480位點磷酸化能破壞NR2B與PSD95的結合，并減少細胞膜表面的NR2B表達，導致NR2B向胞內運輸。
　　2.

9、異氟烷對發(fā)育期海馬神經(jīng)元CK2信號通路的影響
　　選擇同窩出生5天SD大鼠，隨機分組，處理組在相同條件下分別吸入相同濃度異氟烷（MAC1.3）2、4、6小時，對照組吸入空氣，24小時之后處死大鼠并分離海馬組織。采用Western Blot方法，檢測海馬神經(jīng)元CK2、p35、p25的蛋白水平表達變化。結果：臨床相關濃度異氟烷呈劑量依賴性降低CK2表達，增加p35、p25蛋白水平表達（P<0.05）。
　　3.異氟烷對發(fā)育期海馬

10、神經(jīng)元凋亡及Caspase-3表達的影響
　　選擇同窩出生5天SD大鼠，隨機分為對照組、異氟烷吸入組、異氟烷+Minocycline組，異氟烷+Minocycline組大鼠麻醉前12小時預先給予 Minocycline腹腔注射45mg/kg處理，后兩組在相同條件下分別吸入相同濃度異氟烷（MAC1.3）4小時，對照組吸入空氣，24小時之后處死大鼠，取出完整大腦組織制作海馬區(qū)冰凍切片。免疫熒光法檢測海馬神經(jīng)元Caspase-3活性細胞

11、數(shù)量的變化。
　　結果：異氟烷吸入組的Caspase-3活化細胞數(shù)量顯著大于對照組（P<0.05），而加入抑制劑Minocycline的組Caspase-3活化細胞數(shù)量和對照組無明顯差異。
　　4. CDK5抑制劑Roscovitine對異氟烷吸入處理后大鼠海馬神經(jīng)元NMDAR表達的影響選擇同窩的出生5天SD大鼠，隨機分成對照組，Roscovitine組，異氟烷處理組，異氟烷+Roscovitine組。其中Roscoviti

12、ne組和異氟烷+Roscovitine組的大鼠預先給予Roscovitine。在35℃溫箱中，異氟烷處理組和異氟烷+Roscovitine組分別吸入相同濃度異氟烷(Mac1.3)達4小時，氧流量1L/min；對照組和Roscovitine組吸入空氣，24小時之后處死大鼠，分離海馬組織并提取蛋白。采用Western Blot法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元NR2B、p-NR2B（S1480）蛋白水平表達變化。
　　結果：與對照組相比，異氟烷

13、處理組中，細胞膜上NR2B、p-NR2B（Ser1480）表達減少而向胞漿中轉運；而異氟烷+Roscovitine組相比異氟烷組，膜上的NR2B蛋白及磷酸化表達明顯增多（P<0.05）。對照組和 Roscovitine組中這兩種蛋白表達無明顯差異。
　　5.CDK5抑制劑Roscovitine對異氟烷吸入后海馬神經(jīng)元CDK5-p35-CK2信號通路的影響
　　選擇同窩的出生5天SD大鼠，隨機分成對照組，Roscovitine

14、組，異氟烷處理組，異氟烷+Roscovitine組。異氟烷處理組和異氟烷+Roscovitine組分別吸入相同濃度異氟烷(Mac1.3)達4小時，氧流量1L/min；對照組和Roscovitine組吸入空氣，24小時之后處死大鼠，分離海馬組織并提取蛋白。采用 Western Blot法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元CK2、p35/p25蛋白水平表達變化。
　　結果：異氟烷組中CK2較之對照組和Roscovitine組表達明顯減少，p35/

15、p25表達增加（P<0.05）；異氟烷+Roscovitine組CK2的表達比異氟烷組明顯增多，與對照組無顯著差異。
　　6. CDK5抑制劑Roscovitine處理異氟烷吸入的大鼠海馬各區(qū)域p-NR2B（S1480）表達變化
　　選擇同窩的出生5天SD大鼠，隨機分成對照組，Roscovitine組，異氟烷處理組，異氟烷+Roscovitine組。異氟烷處理組和異氟烷+Roscovitine組分別吸入相同濃度異氟烷(Mac

16、1.3)達4小時，氧流量1L/min；對照組和Roscovitine組吸入空氣，24小時之后處死大鼠，分離新鮮腦組織并制作海馬區(qū)的冰凍切片。運用免疫組化法觀察大鼠海馬DG區(qū)、CA1區(qū)、CA3區(qū)神經(jīng)元p-NR2B(S1480)表達數(shù)量的變化。
　　結果：免疫組化切片顯示，與對照組、Roscovitine組相比，異氟烷組大鼠海馬 CA3區(qū)神經(jīng)元NR2B的Ser1480位點磷酸化的細胞數(shù)量明顯減少（P<0.05），CA1、DG區(qū)無明顯差

17、異；異氟烷+Roscovitine組各區(qū)海馬神經(jīng)元磷酸化數(shù)量與對照組相比無明顯差異。
　　7.遠期學習記憶行為學測試
　　選擇同窩出生5天SD大鼠，隨機分成處理組和對照組，處理組在血氧飽和度監(jiān)測下分別吸入相同濃度異氟烷（MAC1.3）2小時、4小時、6小時，對照組吸入空氣，然后在相同生存環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)至成年（8周），采用Barnes Maze行為學測試方法檢測其空間學習記憶功能。
　　結果：測試第5天和第12天，6h組

18、大鼠比對照組、2h組、4h組大鼠進入目標洞的潛伏期均明顯增長（P<0.05），錯誤次數(shù)無明顯差異。
　　統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,組內比較采用one-way ANOVA方差分析,組間比較采用配對t檢驗,P　　研究結論和總結：
　　一、主要研究結果
　　1.5天齡大鼠吸入不同時間的臨床相關濃度異氟烷，證實了其劑量依

19、賴性通過改變NMDAR磷酸化程度和其亞型比例，影響發(fā)育期神經(jīng)元形態(tài)和功能。
　　2.通過在體大鼠吸入異氟烷，證實其通過CK2-CDK5-p35通路影響NMDAR受體構成及功能。
　　3.成年后大鼠行為學實驗提示小劑量的臨床相關濃度異氟烷對發(fā)育期大鼠遠期學習記憶功能并無顯著影響。
　　二、研究結論：
　　1.吸入麻醉藥異氟烷通過下調CK2，過度激活CDK5-p35而磷酸化大鼠發(fā)育期神經(jīng)元中NR2B的Tyr1472位

20、點，引起NR2B向胞內運輸；下調NR2B的Ser1480位點磷酸化，破壞NR2B與PSD95的結合，并減少細胞膜表面的NR2B表達。以上兩方面同時導致NR2B提前轉變?yōu)镹R2A,致發(fā)育期神經(jīng)元生長、突觸形成及可塑性的改變，而這一過程可通過抑制CDK5而達到降低異氟烷神經(jīng)元興奮性毒性的作用。
　　2.成年后SD大鼠Barnes Maze行為學測定空間學習記憶功能方面的實驗結果，表明吸入臨床相關濃度異氟烷適當時間內對發(fā)育期神經(jīng)元遠期神