自噬在七氟烷誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)毒性中的作用及機制研究.pdf

1、七氟烷是最常用的全身麻醉藥物之一，多年來用于小兒麻醉的誘導(dǎo)和維持。大量動物研究表明，發(fā)育期大鼠暴露于七氟烷會導(dǎo)致廣泛的海馬神經(jīng)元凋亡和空間學(xué)習(xí)能力嚴(yán)重缺陷。目前對于七氟烷誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的具體機制尚未完全闡明，因而臨床上迄今亦未尋找到有效的預(yù)防和治療措施。Sanchez等研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥會造成發(fā)育期大鼠長期的線粒體形態(tài)變異和突觸傳遞異常，并伴有自噬活性的增強。由此推測自噬在七氟烷的神經(jīng)毒性中發(fā)揮了一定的作用，也可能是重要的一環(huán)，但目前對

2、于自噬與七氟烷神經(jīng)毒性關(guān)系及神經(jīng)元自噬和凋亡的關(guān)系的研究并不深入。本項目旨在探討七氟烷誘導(dǎo)的新生大鼠海馬組織自噬水平的改變，明確自噬在七氟烷全身麻醉過程中的作用及其相關(guān)機制以及神經(jīng)元自噬和凋亡的關(guān)系，進而尋找相應(yīng)的治療靶點和最安全的臨床暴露時間;由此重點進行了以下兩部分的研究。
　　第一部分 利用動物模型探討七氟烷誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬現(xiàn)象及調(diào)控的具體途徑
　　本研究將新生SD大鼠暴露于不同時間的3.4％七氟烷，通過采用免疫印跡(W

3、estern blotting)檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ和p62，QRT-PCR檢測Beclin-1mRNA、LC3mRNA和p62mRNA的表達，免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色觀察Beclin1、LC3和p62的表達，觀察海馬組織自噬水平的改變，進而探討自噬活性與七氟烷暴露時間的關(guān)系。針對調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典信號通路ClassⅠ PI3K/Akt/mTOR/p70S6K及ClassⅢ PI3K，分別使用自噬誘導(dǎo)劑（雷帕霉

4、素，Rapamycin）、自噬抑制劑（3-甲基腺嘌呤，3-MA）進行干預(yù)，觀察相應(yīng)的自噬水平的變化。同時采用免疫印跡(Western blotting)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax蛋白和Bcl-2蛋白水平，TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生SD大鼠暴露于3.4％七氟烷4小時，重復(fù)3天(4h×3d)后，Western blotting檢測結(jié)果顯示自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3蛋白水平均上調(diào)，而自噬底物p62蛋白水平下調(diào)，同時凋亡相

5、關(guān)蛋白Bax蛋白顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白水平顯著下降。QRT-PCR檢測結(jié)果顯示Beclin-1 mRNA和LC3mRNA均上調(diào)，p62mRNA下調(diào)，免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示Beclin-1和LC3均上調(diào)，p62下調(diào);采用自噬激動劑雷帕霉素激活了自噬，自噬抑制劑3-MA抑制了自噬。TUNEL法檢測結(jié)果顯示tunnel陽性神經(jīng)元細胞數(shù)顯著增加。上述結(jié)果表明，七氟烷可誘導(dǎo)發(fā)育期SD大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生自噬，促進自噬體的形成及

6、溶酶體和自噬體的融合。七氟烷可能通過激活ClassⅢPI3K通路或抑制mTOR來啟動自噬。七氟烷在促進神經(jīng)元自噬發(fā)生的同時也促進神經(jīng)元凋亡的形成。自噬在七氟烷導(dǎo)致發(fā)育期SD大鼠海馬神經(jīng)元毒性的發(fā)展過程中具有非常重要的作用。
　　第二部分 利用海馬神經(jīng)元模型探討七氟烷誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬的形成特點及其相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
　　本研究將原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元分別暴露于不同時間的3.4％七氟烷，通過采用Western blotting檢測海馬

7、神經(jīng)元內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ和p62，凋亡相關(guān)蛋白Bax蛋白和Bcl-2蛋白水平，QRT-PCR檢測Beclin-1 mRNA、LC3mRNA和p62mRNA的表達，免疫細胞熒光染色觀察LC3的表達，RFP-GFP-LC3表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元，監(jiān)測自噬的發(fā)生，利用si RNAKnockdown Beclin-1和Atg5，采用Western blotting檢測LC3-Ⅱ的變化，采用Annexin-Ⅴ/PI檢測

8、細胞凋亡的改變。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元暴露于3.4％七氟烷5h后，Western blotting檢測結(jié)果顯示海馬神經(jīng)元內(nèi)Beclin1和LC3均上調(diào)，而自噬底物p62下調(diào)，同時凋亡相關(guān)蛋白Bax蛋白顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白水平顯著下降。QRT-PCR檢測結(jié)果顯示Beclin-1mRNA和LC3mRNA均上調(diào)，p62mRNA下調(diào)，免疫細胞熒光染色顯示LC3水平上調(diào);用RFP-GFP-LC3表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元，LC3表達

9、上調(diào)，提示自噬被激活。轉(zhuǎn)染siRNA Beclin-1和siRNA Atg5后，Western blotting檢測LC3-Ⅱ下調(diào)，AnnexinⅤ/PI結(jié)果顯示細胞發(fā)生早期和晚期凋亡。上述結(jié)果表明，七氟烷可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元發(fā)生自噬，Beclin1和Atg5調(diào)控的信號通路參與七氟烷誘導(dǎo)自噬的調(diào)控過程。海馬神經(jīng)元七氟烷暴露，不僅可以誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元自噬，而且可以激活海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡。自噬在七氟烷導(dǎo)致原代海馬神經(jīng)元毒性的發(fā)展過程中具