Orexin參與REM期睡眠剝奪后大鼠海馬自噬機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述。
　　第一部分 REM期睡眠剝奪對(duì)大鼠海馬組織自噬水平的影響
　　目的:探究REM期睡眠剝奪后大鼠海馬組織中是否有自噬活動(dòng)參與及其水平的改變。
　　方法:選取SD大鼠為研究對(duì)象，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為REM睡眠剝奪組、水環(huán)境對(duì)照組、正?？瞻讓?duì)照組，采用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法來(lái)建立本實(shí)驗(yàn)所需的睡眠剝奪模型，首先選擇免疫熒光觀察到三組大鼠海馬區(qū)自噬體的形成;隨后利用western blot檢測(cè)大腦海馬

2、組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:REM期睡眠剝奪后，在免疫熒光下可觀察到三組大鼠的海馬組織均有自噬體存在;對(duì)自噬過(guò)程中特征性蛋白LC3B及P62進(jìn)行WB定量檢測(cè)后可見(jiàn):與兩個(gè)對(duì)照對(duì)相比，實(shí)驗(yàn)組的大鼠海馬組織勻漿中LC3B表達(dá)明顯升高(p＜0.05)，P62蛋白表達(dá)量下降(p＜0.05)。同時(shí)兩個(gè)對(duì)照組間LC3B及P62蛋白的表達(dá)量相差不大(p＜0.05)。
　　結(jié)論:REM期睡眠剝奪后大鼠海馬組織的自噬活動(dòng)被激活

3、。
　　第二部分 orexin對(duì)海馬神經(jīng)元誘導(dǎo)時(shí)間、濃度的篩選及對(duì)應(yīng)自噬蛋白的表達(dá)
　　目的:觀察orexin對(duì)體外海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性及自噬水平的影響。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠原代海馬細(xì)胞為研究對(duì)象，給予不同濃度梯度(0mol/L、10-11mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L)的orexin干預(yù)2小時(shí)和時(shí)間梯度(0h、2h、4h、6h、8h)10-7mol/LOrexin進(jìn)行刺激，利用CCK8試劑盒檢

4、測(cè)不同干預(yù)條件下的細(xì)胞活性的變化;另外，針對(duì)自噬的改變，首先利用細(xì)胞免疫熒光下觀察是否有自噬小體存在，隨后利用WB對(duì)不同時(shí)間和不同濃度的orexin干預(yù)后自噬蛋白P62進(jìn)行定量檢測(cè)選取最合適的實(shí)驗(yàn)條件。
　　結(jié)果:在刺激2小時(shí)的條件下，隨著orexin濃度的不斷增加海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性率也逐漸上升，選擇濃度10-7mol/L組與其空白組相比，結(jié)果有差異(P＜0.05);而固定orexin的刺激濃度10-7mol/L后，隨著干預(yù)時(shí)間的

5、延長(zhǎng)，海馬神經(jīng)元細(xì)胞的活性也呈增高趨勢(shì)，在4小時(shí)節(jié)點(diǎn)檢測(cè)的細(xì)胞活性較空白對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。細(xì)胞免疫熒光下可見(jiàn)自噬體的存在;與自噬活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)的P62蛋白的表達(dá)量隨著orexin的刺激時(shí)間和干預(yù)濃度的延長(zhǎng)表達(dá)含量升高，與空白組相比orexin10-7mol/L組及干預(yù)4h組的P62蛋白表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:orexin能增加體外海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性率，同時(shí)對(duì)細(xì)胞自噬活動(dòng)產(chǎn)生抑制效應(yīng);該功能具有時(shí)

6、間和濃度依賴性。
　　第三部分 orexin對(duì)海馬神經(jīng)元自噬水平影響的可能機(jī)制
　　目的:初步探索orexin影響海馬神經(jīng)元自噬活性可能的機(jī)制。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)選用海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，利用實(shí)驗(yàn)二的結(jié)果選取刺激條件后(10-7mol/L、4h)，隨后從orexin和自噬兩方面進(jìn)行干預(yù)，將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、orexin組、orexin受體阻滯劑(almorexant)組、自噬激活劑(rapamycin)組、ore

7、xin+almorexant組及orexin+rapamycin組。利用WB檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62的表達(dá)水平評(píng)估自噬水平的改變，隨后對(duì)各組標(biāo)本進(jìn)行電鏡觀察，更直觀觀察自噬體的變化。
　　結(jié)果:orexin組beclin1蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組下降，自噬活動(dòng)抑制(p＜0.05);加入orexin受體抑制劑組、自噬激活劑的兩組細(xì)胞，與orexin干預(yù)組相比beclin1蛋白表達(dá)顯著增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

8、);若同時(shí)加入orexin+其受體阻滯劑或同時(shí)加入orexin+自噬激活劑后，則觀察到這兩組中beclin1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組數(shù)值相差不大(P＞0.05)，但較單純加入orexin組相比較，表達(dá)增多(p＜0.05)。相反，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中與自噬活性呈負(fù)相關(guān)的蛋白P62的表達(dá)量在加入食欲素(orexin)刺激后表達(dá)上升，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而食欲素受體抑制劑組、自噬激活劑組中P62蛋白表達(dá)水平下降，相比與對(duì)照組有意義(P