2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、脊髓背角是疼痛形成的初級中樞,眾多研究已表明,脊髓背角的中樞敏化在骨癌痛的產(chǎn)生和形成過程中起著重要作用。外周傷害性信息首先傳遞到脊髓背角,在此匯聚和整合后再向上傳遞,最后形成痛覺。但是,有研究表明,脊髓背角對傷害性信息的傳遞受到脊髓上中樞如延髓、前扣帶皮層(ACC)等調(diào)控。這種調(diào)控又分為下行性抑制和易化兩種,這在疼痛的形成中同樣起著重要作用。研究脊髓上中樞如何調(diào)控脊髓活動成為近來疼痛研究領域的熱點。
  前扣帶皮層是邊緣系統(tǒng)的重要

2、結構,可接受來自丘腦的纖維傳入,例如前內(nèi)側丘腦核、中央下核等。這些丘腦核團大都接受來自脊髓的傷害性信息傳入。因此脊髓的傷害性信息通過丘腦可傳入ACC。在ACC放置記錄電極,截斷下肢可引起ACC產(chǎn)生興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs)。ACC不但接受外界的信息傳入,還輸出信號影響調(diào)節(jié)其它核團的功能。例如將實施刺激的對側足截斷,結果正常足上刺激引起的反應加強。這提示前扣帶皮層吻側部

3、(rACC)神經(jīng)元的可塑性改變在疼痛中起著重要作用。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導神經(jīng)元的可塑性變化,在前腦主要以NMDA2B受體(NR2B)形式存在。這些研究提示,rACC神經(jīng)元的NR2B可能在骨癌痛的形成中起到重要作用。本課題采用疼痛行為學、免疫組織化學及分子生物學等方法探討rACC神經(jīng)元NR2B亞基參與骨癌痛形成的分子機制并為臨床骨癌痛治療提供實驗依據(jù)。
  第一部分 骨癌痛大鼠前扣帶皮層吻側部神經(jīng)元NR2B亞基

4、表達的變化
  目的:
  觀察骨癌痛大鼠rACC腦區(qū)NR2B亞基的表達水平。
  方法:
  成年Sprague Dawley(SD)大鼠,雌雄不拘,體重200-250g,采取隨機數(shù)字表隨機分為空白對照組(Naive組),假手術組(Sham組)及骨癌痛組(Tumor-bearing組)。Tumor-bearing組脛骨上段骨髓腔接種MADB-106大鼠乳腺癌細胞懸液10μl(細胞密度約5×106/ml),而Sh

5、am組注射同等劑量的生理鹽水。術前及術后21天內(nèi)每隔3天,測定大鼠機械痛閾值和熱痛潛伏期以觀察大鼠痛行為的改變。根據(jù)痛行為學的改變,選取痛行為改變最明顯的4只大鼠,采用免疫組化技術和免疫印跡技術檢測rACC神經(jīng)元NR2B亞基的表達水平。
  結果:
  機械痛閾值及熱痛潛伏期三組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而從術后第3天開始Tumor-bearing組機械縮爪閾值及熱痛潛伏期明顯降低,與Naive組和Sham組比較降

6、低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術后14天下降最顯著,至術后21天仍顯著低于對照組。這提示大鼠出現(xiàn)明顯痛覺過敏,模型復制成功。免疫熒光顯示,術后14天大鼠rACC神經(jīng)元NR2B陽性的數(shù)目,Tumor-bearing組顯著高于Naive組和sham組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。采取術后14天的大鼠rACC腦組織以Western blot分析顯示,Tumor-bearing組大鼠術后14天rACC神經(jīng)元NR2B表達水平較術前明

7、顯升高,與對照組比較也顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
  結論:
  脛骨髓腔內(nèi)注射MADB-106大鼠乳腺癌細胞14天成功復制大鼠骨癌痛模型,同時伴隨NR2B亞基的高表達。
  第二部分 rACC內(nèi)注射NR2B拮抗劑Ifenprodil對骨癌痛大鼠機械痛域和熱痛潛伏期的影響
  目的:
  第一部分研究結果表明,骨癌痛引起rACC神經(jīng)元NR2B亞基的表達升高,rACC內(nèi)給予NR2B拮抗劑是否

8、減輕骨癌痛?因此,本部分觀察rACC內(nèi)注射Ifenprodil對骨癌痛機械痛域和熱痛潛伏期的影響。
  方法:
  根據(jù)Paxinos and watson腦定位圖譜定位rACC的位置(前囟前1.7mm,旁開0.6mm,深2.5mm),埋管。術后觀察7天,無異常大鼠采用脛骨髓腔注射MADB-106大鼠乳腺癌細胞復制骨癌痛模型。骨癌痛大鼠大隨機分為五組: Naive組,BCP組,BCP+NS組,BCP+Ifenprodil組,

9、BCP+CNQX組。BCP+Ifenprodil組左右兩側rACC給予Ifenprodil0.6μl(0.2g/L),而對照組給予同等劑量的生理鹽水或CNQX。測定給藥前后骨癌痛大鼠的機械痛閾值,和熱痛潛伏期。痛行為學測試完畢后,采用免疫組化法檢測脊髓背角C-fos神經(jīng)元的表達。
  結果:
  給藥前Naive組,BCP組,BCP+NS組,BCP+Ifenprodil組,BCP+CNQX,五組機械痛閾值和熱痛潛伏期差異無統(tǒng)

10、計學意義(P>0.05)。注射Ifenprodil后脛骨癌痛大鼠的機械痛閾值和熱痛潛伏期,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫組化顯示,脊髓背角C-fos的表達BCP+Ifenprodil組低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
  結論:
  骨癌痛大鼠rACC腦區(qū)給予NR2B拮抗劑Ifenprodil減輕大鼠的痛敏,并減少脊髓背角C-fos神經(jīng)元的表達。
  第三部分 重組慢病毒載體shRN

11、A/NR2B(LV-GluN2B)的構建及抑制NR2B效率的檢測
  目的:
  盡管rACC內(nèi)給予Ifenprodil可減輕骨癌痛,但是Ifenprodil鎮(zhèn)痛作用不但時間短暫而且具有副作用,因此尋找一種鎮(zhèn)痛時間長且安全有效的鎮(zhèn)痛措施是目前臨床所急需的。小RNA技術選擇性沉默目的基因的表達已成為一種成熟的方法,選擇性沉默rACC神經(jīng)元NR2B亞基的表達可實現(xiàn)長期鎮(zhèn)痛。因此,本研究擬構造siRNA/NR2B重組慢病毒載體以期

12、實現(xiàn)此目的。
  方法:
  根據(jù)基因庫中大鼠NR2B亞基的mRNA序列及shRNA序列的設計原則,設計3條19nt的靶序列,進一步合成含有互補鏈的DNA。將此DNA插入到pFU-GW-iRNA載體質粒H1啟動子的下游,進而獲得3個含有shRNA/NR2B的重組質粒pFU-GW-iRNA/NR2B。同時構建一個陰性對照質粒。將合成的3個重組質粒和NR2B表達質粒共轉染293T細胞,以Western blot檢測目的蛋白NR2

13、B的表達,進而確定沉默效率最高的重組質粒。再將該質粒轉染293T細胞,即包裝含有shRNA/NR2B重組慢病毒即LV-GluN2B。
  結果:
  聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)產(chǎn)物經(jīng)電泳分析,構建的重組質粒含有341bp大小的條帶即NR2B-RNAi。結合測序結果表明,重組質粒構建成功。Western blot結果表明,Plv-NR2B3對目的基因NR2B敲減效率最高。通過轉染

14、293T細胞,最終合成可有效沉默目的基因NR2B的重組慢病毒LV-GluN2B。
  結論:
  重組NR2B-RNAi慢病毒LV-GluN2B構建成功。
  第四部分 選擇性下調(diào)rACC神經(jīng)元NR2B基因的表達對骨癌痛大鼠痛覺的影響
  目的:
  首先建立大鼠骨癌痛模型,采用腦立體定位技術rACC內(nèi)注射shRNA/NR2B重組慢病毒,通過下調(diào)rACC神經(jīng)元NR2B亞基的表達水平觀察下調(diào)NR2B對大鼠骨癌

15、痛的治療作用。
  方法:
  脛骨癌痛大鼠rACC埋管后按照數(shù)字表隨機分為三組:即生理鹽水組、LV-NC組及LV-GluN2B組,每組8只。采用疼痛測定儀分別測量給藥前,及給藥后每隔3天大鼠的機械痛閾值,以及熱痛潛伏期。在痛行為學效果最顯著時間點取大鼠rACC腦組織,采用免疫組化,PCR及Western blot方法檢測LV-GluN2B對NR2B基因的敲減效率。
  結果:
  給藥前三組之間的機械痛閾值和熱

16、痛潛伏期差異無統(tǒng)計意義(P>0.05),而rACC內(nèi)給予LV-GluN2B后骨癌痛大鼠的機械痛閾值和熱痛潛伏期均顯著升高,與生理鹽水組和LV-NC組比較,顯著升高,(P<0.05)。而生理鹽水組和LV-NC組與給藥前比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。WB和PCR結果表明,LV-GluN2B組rACC神經(jīng)元NR2B蛋白和NR2BmRNA表達水平均低于對照組(P<0.05)。
  結論:
  rACC內(nèi)給予重組慢病毒LV-G

17、luN2B通過下調(diào)NR2B的表達減輕骨癌痛。
  研究意義:
  本研究首先采用痛行為學和分子生物學方法,觀察到骨癌痛可導致rACC神經(jīng)元NR2B表達水平的上調(diào),進一步通過注射NR2B阻斷劑Ifenprodil發(fā)現(xiàn)可減輕骨癌痛,提示rACC神經(jīng)元NR2B在骨癌痛的產(chǎn)生和形成中起到重要作用。在此基礎上,為了實現(xiàn)鎮(zhèn)痛的長期性、有效性及安全性,構建了NR2B-RNAi重組慢病毒(LV-GluN2B),實現(xiàn)了高選擇性下調(diào)rACC神經(jīng)

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