MHCⅡ參與骨癌痛形成的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　據(jù)國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2015年我國預計新增的惡性腫瘤病例達429.2萬例，其中肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等高轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤發(fā)病比例較高。有報道指出75～90％進展期及終末期的癌癥病人必須接受慢性疼痛治療，其中骨癌痛是治療的重要部分。骨癌痛常發(fā)生于原發(fā)性的骨骼惡性腫瘤或繼發(fā)于前列腺癌、肺癌、乳腺癌等最常波及骨骼的高轉(zhuǎn)移性腫瘤。當累及骨骼時，起初表現(xiàn)為鈍性疼痛，逐漸進展為中至重度的持續(xù)痛并伴有爆發(fā)痛，嚴重影響

2、患者的生活質(zhì)量。隨著診療技術的發(fā)展，癌癥患者的生存率顯著增加，因此惡性腫瘤導致的骨骼疼痛成為迫切需要解決的問題之一，然而骨癌痛的發(fā)病機制目前所知有限，極大地阻礙了對骨癌痛的有效治療。
　　研究發(fā)現(xiàn)，慢性疼痛的發(fā)生是以基因背景為基礎，與個體所處客觀環(huán)境相互作用的結(jié)果，其中的候選基因包括HLA。脊髓是慢性疼痛發(fā)生中樞敏化的關鍵部位，研究發(fā)現(xiàn)，主要組織相容性復合體Ⅱ（Major Histocompatibility ClassⅡ，MHC

3、Ⅱ）高表達于慢性疼痛動物的脊髓背角，抑制該分子表達能夠顯著改善神經(jīng)損傷導致的異常疼痛和痛覺超敏。據(jù)此推測MHCⅡ可能是介導慢性疼痛中樞敏化的分子之一，然而該分子在骨癌痛發(fā)生中的作用目前所知甚少。
　　JAK/STAT1信號通路執(zhí)行細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活兩個方面的功能，在抗原遞呈細胞內(nèi)參與啟動CⅡTA（MHC ClassⅡ Transactivator，CⅡTA）的轉(zhuǎn)錄，而CⅡTA又調(diào)控MHCⅡ的表達，因此，JAK/STAT1信

4、號通路是調(diào)控MHCⅡ表達的重要因素，抑制該通路后有可能緩解骨癌痛癥狀。MEK/ERK信號通路是參與小膠質(zhì)細胞激活的MAPK成員之一，主要執(zhí)行小膠質(zhì)細胞的增殖和促炎性介質(zhì)的釋放，研究指出，
　　JAK/STAT1與MEK/ERK信號通路之間存在著相互聯(lián)系，據(jù)此我們提出研究假說：脊髓背角小膠質(zhì)細胞JAK/STAT1信號通路激活，通過調(diào)控CⅡTA的表達導致MHCⅡ分子表達上調(diào)并參與骨癌痛的發(fā)生；此外，MEK/ERK信號通路與JAK/ST

5、AT1信號通路之間存在相互聯(lián)系。
　　1、MHCⅡ參與骨癌痛發(fā)生
　　方法：
　　實驗一：選擇健康成年雌性健康SD大鼠隨機分為正常組、假手術組和骨癌痛組，建立骨癌痛大鼠模型，分別在模型建立前和模型建立后3、7、10、14和21 d測定手術側(cè)肢體的機械性縮爪閾值（Mechanical Paw Withdrawal Threshold，MPWT），利用Western blot和免疫熒光染色檢測MHCⅡ及其調(diào)控分子CⅡTA在

6、脊髓的表達變化情況。
　　實驗二：建立骨癌痛大鼠動物模型，鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素或者脊髓微注射LV-CⅡta-RNAi定向沉默CⅡTA，觀察下調(diào)MHCⅡ表達后大鼠疼痛行為的變化，免疫熒光染色觀察慢病毒在脊髓背角的轉(zhuǎn)染效果，RT-PCR驗證LV-CⅡta-RNAi沉默 CⅡTA情況；選擇LV-CⅡta-RNAi及陰性對照慢病毒干擾的骨癌痛大鼠和正常大鼠，鞘內(nèi)注射重組大鼠IFNγ誘導MHCⅡ表達上調(diào)，并驗證LV-CⅡta-RNAi沉默CⅡT

7、A的效果。Western blot檢測干預后CⅡTA和MHCⅡ在脊髓的表達變化。
　　結(jié)果：
　　骨癌痛組大鼠在模型建立后7、14和21 d表現(xiàn)為典型的異常疼痛，同時CⅡTA和MHCⅡ的蛋白表達水平顯著上調(diào)。鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素或脊髓微注射LV-CⅡta-RNAi均能夠顯著抑制MHCⅡ的表達上調(diào)，并明顯改善骨癌痛癥狀。鞘內(nèi)注射重組大鼠IFNγ能誘導MHCⅡ在陰性對照病毒注射的骨癌痛大鼠和正常大鼠脊髓的表達上調(diào)，對LV-CⅡta-

8、RNAi干擾的骨癌痛大鼠無顯著影響。
　　2、JAK/STAT1和MEK/ERK信號通路激活并參與骨癌痛發(fā)生方法
　　研究方法與結(jié)果：
　　實驗一：選擇健康成年雌性SD大鼠隨機分為正常組、假手術組和骨癌痛組，建立骨癌痛大鼠模型，分別在模型建立前和模型建立后3、7、10、14和21 d測定手術側(cè)肢體的MPWT，利用Western blot和免疫熒光染色檢測pSTAT1和pERK在脊髓的表達變化情況。
　　實驗二：建

9、立骨癌痛大鼠模型，鞘內(nèi)注射JAK抑制劑AG490、STAT1抑制劑Fludarabine和MEK抑制劑U0126，每日1次；分別在模型建立前和建立后3、7、10和14 d觀察手術側(cè)肢體的MPWT；于手術后14 d安樂死大鼠取脊髓腰膨大，利用Western blot檢測pSTAT1、pERK、CⅡTA和MHCⅡ的表達變化。
　　結(jié)果：
　　骨癌痛大鼠脊髓的pSTAT1和pERK的表達水平顯著上調(diào)。鞘內(nèi)注射Fludarbine和

10、U0126能夠顯著地抑制pSTAT1、pERK、CⅡTA和MHCⅡ的表達上調(diào)，同時顯著性地改善骨癌痛的MPWT下調(diào)，而AG490對上述作用有限。
　　3、JAK/STAT1和MEK/ERK信號通路激活介導原代小膠質(zhì)細胞MCHⅡ的表達方法
　　體外培養(yǎng)出生24 h內(nèi)大鼠大腦皮層的原代小膠質(zhì)細胞，重組大鼠IFNγ誘導JAK/STAT1和MEK/ERK信號通路激活；干預組在IFNγ刺激前30 min分別加入AG490、Fludar

11、abine和U0126，24 h后提取細胞總蛋白，利用Western blot檢測pSTAT1、pERK、CⅡTA和MHCⅡ蛋白表達水平的變化情況。
　　結(jié)果：
　　IFNγ能夠顯著地激活JAK/STAT1和MEK/ERK信號通路，同時導致CⅡTA和MHCⅡ的表達顯著上調(diào)；抑制劑Fludarabine或U0126分別顯著抑制JAK/STAT1或MEK/ERK信號通路激活，但均能夠抑制CⅡTA和MHCⅡ的表達上調(diào)，其中U012

12、6能夠抑制 STAT1的磷酸化激活，而Fludarabine對ERK的磷酸化水平無顯著影響；AG490對上述通路激活的抑制作用相對有限。
　　4、統(tǒng)計分析
　　數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件進行分析，計量資料以?x±SEM表示；兩個變量之間比較采用獨立樣本t檢驗；多個變量的比較采用one-way ANOVA，組間行為學結(jié)果
　　分析采用two-way ANOVA；統(tǒng)計結(jié)果的圖片制作采用GraphPad prism5，

13、p<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　研究總結(jié)：
　　1、主要研究結(jié)果
　　1.1骨癌痛大鼠脊髓MHCⅡ表達上調(diào)，特異地表達于小膠質(zhì)細胞；鞘內(nèi)注射小膠質(zhì)細胞抑制劑或脊髓微注射慢病毒定向沉默CⅡTA基因，能顯著降低MHCⅡ的表達水平，并顯著改善大鼠的骨癌痛癥狀；
　　1.2骨癌痛大鼠脊髓信號通路JAK/STAT1和MEK/ERK激活，磷酸化激活性的pSTAT1和pERK表達于小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞；鞘內(nèi)注射抑

14、制劑能顯著抑制信號通路，并抑制MHCⅡ的表達上調(diào)，同時顯著緩解骨癌痛大鼠的痛覺異常；
　　1.3重組大鼠IFNγ刺激體外培養(yǎng)的大鼠原代小膠質(zhì)細胞，能夠激活信號通路JAK/STAT1和MEK/ERK，并誘導MHCⅡ的表達水平上調(diào)；抑制信號通路激活能夠顯著抑制MHCⅡ的表達。
　　2、研究結(jié)論
　　2.1骨癌痛大鼠的脊髓小膠質(zhì)細胞表達MHCⅡ并介導骨癌痛發(fā)生；2.2JAK/STAT1是調(diào)節(jié)MHCⅡ表達的重要信號通路；

15、>　　2.3小膠質(zhì)細胞的信號通路MEK/ERK對JAK/STAT1有單向調(diào)控作用。
　　3、創(chuàng)新之處
　　3.1首次揭示了MCHⅡ分子在骨癌痛發(fā)生中的作用；3.2首次發(fā)現(xiàn)JAK/STAT1信號通路參與骨癌痛發(fā)生；
　　3.3揭示了骨癌痛病理情況下，小膠質(zhì)細胞的信號通路MEK/ERK對JAK/STAT1的單向調(diào)控作用。
　　4、展望
　　4.1本研究發(fā)現(xiàn)MHCⅡ表達于骨癌痛大鼠脊髓的小膠質(zhì)細胞，可能是骨癌痛治

16、療的新靶點，然而MHCⅡ分子是否參與抗原遞呈功能并誘導外周的CD4+T細胞遷移進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，二者相互作用導致脊髓的神經(jīng)炎癥反應，進而參與骨癌痛病理過程。
　　目前仍然不明確，需要在將來的工作中進一步研究；
　　4.2該研究證實小膠質(zhì)細胞的信號通路JAK/STAT1和MEK/ERK激活，誘導MHCⅡ表達并參與骨癌痛發(fā)生，揭示了骨癌痛形成的信號通路調(diào)控機制，然而上述信號通路介導的生物學功能復雜，二者之間存在密切聯(lián)系，在揭示其