抗p-185的His6-H520C9scFv的真核載體、穩(wěn)定細胞株構建及其蛋白活性研究.pdf

1、目的：
　　構建和鑒定表達抗p185且含His6標簽的H520C9scFv的真核表達載體,將其轉染入293細胞。經過G418的篩選,建立穩(wěn)定表達His6-H520C9scFv的293細胞株,用RT-PCR、Westernblot檢測His6-H520C9scFv的表達,及細胞免疫熒光法證明其可與表達p185的腫瘤細胞靶向結合。
　　方法：
　　以pcDNA-H520C9scFv-hIL-2質粒為模板,通過PCR獲得H5

2、20C9scFv片段,將此片段通過基因重組插入真核表達質粒pcDNA3.1(+)中。設計引物在H520C9scFv片段C端增加His6標簽和凝血酶識別序列,再與質粒pcDNA3.1(+)連接,構建真核表達載體pcDNA3.1-His6-H520C9scFv。對所得的重組基因進行限制性內切酶EcoRI、HindIII雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并測定目的序列。用LipofectamineLTXandPLUS將重組質粒pcDNA3.1-Hi

3、s6-H520C9scFv轉染進入293細胞,通過G418進行篩選,構建穩(wěn)定表達His6-H520C9scFv的293細胞株。用RT-PCR、Westernblot檢測His6-H520C9scFv在293細胞中的表達,免疫熒光法檢測His6-H520C9scFv融合蛋白與表達p185的人乳腺癌細胞SK-Br3的特異結合。
　　結果：
　　成功擴增出H520C9scFv片段;成功構建重組質粒pcDNA3.1-His6-H52

4、0C9scFv;RT-PCR、Westernblot檢測到293細胞中His-H520C9scFv的表達;免疫熒光法證明His6-H520C9scFv融合蛋白可與帶表達p185的人乳腺癌細胞SK-Br3的特異結合。
　　結論：
　　本研究成功構建了真核表達載體pcDNA3.1-His6-H520C9scFv,并建立了穩(wěn)定表達His-H520C9scFv的293細胞株,證明了His-H520C9scFv融合蛋白可與HER2陽性