抗HER2的His6-H520C9scFv-tP融合蛋白的基因構(gòu)建、表達(dá)、活性分析及其DNA裝載的研究.pdf

1、目前對(duì)于惡性腫瘤的治療，傳統(tǒng)的手段包括手術(shù)治療、放療、化療等都難以達(dá)到預(yù)期的效果。近年來，隨著基因工程技術(shù)的高速發(fā)展，抗體在惡性腫瘤的診斷、治療上日益成為研究的熱點(diǎn)。單鏈抗體(ScFv)因其具有抗原結(jié)合活性、分子量小、穿透力強(qiáng)、體內(nèi)循環(huán)半衰期短及排除了Fc段所致的免疫復(fù)合物反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，而成為新型的腫瘤治療靶向載體，在基因工程抗體研究領(lǐng)域中顯示出廣闊的前景。魚精蛋白被證實(shí)是一種具有很強(qiáng)的DNA結(jié)合能力的強(qiáng)堿性蛋白。但魚精蛋白分子量較大，且

2、組織穿透性差，目前大多研究主要集中在既具有DNA結(jié)合能力同時(shí)分子量又相對(duì)較小的魚精蛋白截短體(tP)上。本研究的目的在于將人源化抗HER2的ScFv與tp利用重組的方法，構(gòu)建出既能識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合位點(diǎn)，有具有核酸結(jié)合能力的雙功能融合蛋白(ScFv/tP)，并對(duì)該融合蛋白的功能進(jìn)行鑒定研究；同時(shí)為開發(fā)出依賴抗體介導(dǎo)的腫瘤靶向治療藥物提供平臺(tái)基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一：
　　目的：構(gòu)建抗HER2的ScFv/tP融合基因

3、　　方法：以攜帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的pcDNA3.1-His6-H520C9ScFv質(zhì)粒為模版，通過PCR擴(kuò)增，再用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I雙酶切pcDNA3.1-His6-H520C9ScFv，經(jīng)電泳、純化后獲得ScFv。人工合成兩條（正向和反向）編碼22個(gè)氨基酸的魚精蛋白縮短體序列的寡核苷酸，并在寡核苷酸鏈的兩端引入帶有EcoR I及Xho I酶切位點(diǎn)的粘端序列。將兩條tp經(jīng)緩慢退火后，與經(jīng)Hind III和EcoR I

4、雙酶切得到的ScFv cDNA片段一起聯(lián)接，插入經(jīng)Hind III和Xho I雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-His6中，獲得人源化抗HER2的pcDNA3.1-His6-H520C9ScFv/tp真核表達(dá)載體。將所得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，進(jìn)行Hind III和Xho I雙酶切鑒定、瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測(cè)序。
　　結(jié)果及結(jié)論：經(jīng)過雙酶切鑒定以及測(cè)定序列證實(shí)：所擴(kuò)增的目的基因序列正確，成功構(gòu)建出含人

5、源化抗HER2的質(zhì)粒pcDNA3.1-His6—H520C9ScFv/tP真核表達(dá)載體。
　　實(shí)驗(yàn)二：
　　目的：ScFv/tp融合蛋白的表達(dá)以及純化
　　方法：通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將重組pcDNA3.1-His6-H520C9ScFv/tP真核表達(dá)載體導(dǎo)入293細(xì)胞，并用G418篩選轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，以獲得穩(wěn)定表達(dá)ScFv/tP融合蛋白的293細(xì)胞體系。將篩選得到的高表達(dá)的293細(xì)胞大量培養(yǎng)，提取后以獲得大量的ScFv

6、/tP融合蛋白，并通過Western-blot檢測(cè)該融合蛋白在293細(xì)胞中的表達(dá)情況，利用His標(biāo)簽，通過鎳柱親和層析純化目標(biāo)蛋白。
　　結(jié)果及結(jié)論：經(jīng)Western-blot檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的293細(xì)胞中能表達(dá)含有His標(biāo)簽的ScFv/tP融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定證實(shí)所獲得的ScFv/tP融合蛋白大小與預(yù)計(jì)大小一致，約36kDa。
　　實(shí)驗(yàn)三：
　　目的：ScFv/tP融合蛋白的活性分析及DNA結(jié)合能力研

7、究
　　方法：選用HER2陽性的人卵巢癌 SKOV-3ip1細(xì)胞，HER2陰性的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞來檢測(cè)ScFv/tP融合蛋白的靶向性。間接免疫熒光檢測(cè)人卵巢癌SKOV-3ip1細(xì)胞，人肝癌SMMC-7721細(xì)胞對(duì)ScFv/tP融合蛋白的內(nèi)吞效果；凝膠遷移阻滯試驗(yàn)檢測(cè)ScFv/tP融合蛋白與DNA結(jié)合活性；ELISA檢測(cè)融合蛋白與抗原的結(jié)合活性；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外源DNA與ScFv/tP融合蛋白結(jié)合的最佳比例；熒光倒置顯

8、微鏡觀察融合蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)外源DNA的情況。
　　結(jié)果：間接免疫熒光檢測(cè)提示ScFv/tP融合蛋白可內(nèi)化進(jìn)入人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3ip1，但不能內(nèi)化進(jìn)入人肝癌細(xì)胞 SMMC-7721；凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)提示ScFv/tP融合蛋白具有DNA結(jié)合活性；ELISA提示融合蛋白能與細(xì)胞表面的HER2抗原特異性結(jié)合；熒光顯微鏡觀察ScFv/tP融合蛋白對(duì)外源DNA的靶向運(yùn)轉(zhuǎn)情況。
　　討論：ScFv/tP融合蛋白能夠被人卵巢癌細(xì)胞內(nèi)化進(jìn)入細(xì)