HBX基因轉(zhuǎn)化人肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：乙肝病毒(HBV)的慢性感染與肝細(xì)胞癌(HCC)之間存在著密切的聯(lián)系，然而HBV誘發(fā)HCC的確切機(jī)制仍不十分清楚。有研究表明，乙肝病毒X基因(HBV X)及其編碼的蛋白在HCC的發(fā)生中起著重要的作用，為進(jìn)一步探討HBV X基因在與HBV相關(guān)HCC發(fā)生發(fā)展中的作用，李濤等以人源性永生化非瘤性肝細(xì)胞株QSG-7701為研究對(duì)象，建立了HBV X基因真核表達(dá)載體pCMV/X并將其導(dǎo)入QSG-7701細(xì)胞，獲得了可穩(wěn)定表達(dá)HBV X基因的

2、肝細(xì)胞株pCMV X/QSG7701，為nBx致癌機(jī)制的研究建立一個(gè)高蛋白表達(dá)的細(xì)胞模型。而我將利用這個(gè)細(xì)胞膜型，進(jìn)一步研究HBX轉(zhuǎn)染的QSG-7701細(xì)胞的生物學(xué)及其形態(tài)學(xué)方面的變化，為治療HBV相關(guān)的HCC找到新的突破口。 方法：① pCMV X/QSG7701細(xì)胞、pRcCMV2/QSG7701細(xì)胞、QSG7701細(xì)胞分別復(fù)蘇和培養(yǎng)。②用免疫熒光的方法檢測(cè)pCMV X/QSG7701細(xì)胞中HBX蛋白的表達(dá)和分布。③用RT-

3、PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中c-Myc、Bcl-2 mRNA的表達(dá)。④用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞中c-Myc、Bcl-2蛋白的表達(dá)。⑤用光鏡及電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。 結(jié)果：①．HBX蛋白主要分布在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿。②用 RT-PCR方法分別檢測(cè)三種測(cè)細(xì)胞中c-Myc、Bcl-2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明pcmv/x轉(zhuǎn)染細(xì)胞中c-Myc mRNA的表達(dá)水平較其他兩組明顯升高(P<0.01)。Bcl-2 mRNA在三組細(xì)胞中均有表達(dá)，但表達(dá)

4、水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。③用免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測(cè)三種細(xì)胞中c-Myc、Bcl-2蛋白的表達(dá)，檢測(cè)表明pcmv/x轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中c-Myc蛋白的表達(dá)水平較其他兩組明顯升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白在三組細(xì)胞中均有表達(dá)，但表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。④．光鏡和電鏡下對(duì)pCMVX/QSG7701細(xì)胞、pRc-CMV2/QSG7701細(xì)胞與QSG7701細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)pCMV X/QSG細(xì)胞的胞核較大，核膜顯得增厚，核

5、仁肥大且增多，核/漿比例失調(diào)，可見(jiàn)少量多核巨細(xì)胞。pRc-CMV2/QSG7701細(xì)胞與QSG7701細(xì)胞核漿比正常，染色質(zhì)分布均勻，胞核大小及形態(tài)也是正常的。 結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)，HBX轉(zhuǎn)染的永生化非瘤性肝細(xì)胞QSG7701中(pCMV X/QSG7701細(xì)胞)，HBX蛋白主要分布在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中。在mRNA及蛋白水平分別檢測(cè)了三種細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了X基因的QSG7701細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)水平較其他