肝細(xì)胞癌中HBx對促凋亡蛋白PUMA的影響與機制研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌在我國已成為第二位的腫瘤死亡原因，乙型肝炎病毒感染是其主要流行病學(xué)原因之一。目前研究認(rèn)為HBx在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用;HBx是HBV在宿主細(xì)胞內(nèi)合成的一種具有多種生物功能的重要蛋白，研究表明HBx可以調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，這些基因涉及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝、及免疫反應(yīng)等。P53是一個重要的腫瘤抑制基因，其作用與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等有關(guān)。p53的變異或失活將促進(jìn)癌

2、癥的發(fā)生，大約超過50％的人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)p53基因突變或缺失，而肝細(xì)胞癌中p53基因的缺失率高達(dá)64.3％，臨床中用免疫組化方法檢測肝癌中突變型p53蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞肝癌中p53蛋白表達(dá)陽性率顯著高于癌旁組織，且與腫瘤分化正相關(guān)，低分化肝癌p53蛋白表達(dá)高于高分化肝癌。突變p53蛋白不僅失去野生型p53的部分功能，而且在肝硬化及肝癌組織中堆積，通過與野生型p53的雜合型聚合或反而獲得原癌基因激活功能，使野生型p53基因誘導(dǎo)凋亡、阻滯

3、細(xì)胞周期及DNA修復(fù)的功能受損。在一些腫瘤中NFκB可能具有與p53相反的作用，肝癌中NFκB通過調(diào)節(jié)calpain small subunitl、cyclinD1促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，也可能通過對靶基因MMP-9、VEGF等的調(diào)節(jié)促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前研究表明，在肝癌中，HBx的表達(dá)可以反式激活NFκB和抑制p53的功能，一個方面HBx通過誘導(dǎo)細(xì)胞漿中的NFκB抑制蛋白IκB-a和p105的降解、或影響IκB-a結(jié)合到NFκ

4、B的DNA結(jié)合部位、或通過蛋白酶體抑制NFκB的降解，激活NFκB;另一方面HBx通過誘導(dǎo)p53的磷酸化使其表達(dá)水平下降，也可通過C端第102、136位氨基酸與p53的DNA結(jié)合區(qū)和寡聚化功能區(qū)結(jié)合，形成復(fù)合物抑制p53轉(zhuǎn)位入核抑制其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。腫瘤細(xì)胞凋亡機理的異常是導(dǎo)致腫瘤逃脫免疫細(xì)胞的攻擊，產(chǎn)生免疫豁免，使腫瘤得以生存和發(fā)展的另一機制。PUMA既是P53基因的一個關(guān)鍵靶基因，也是Bcl-2相關(guān)蛋白家族中僅含一BH3結(jié)構(gòu)域的一種蛋

5、白，通過二種不同的方式發(fā)揮其促凋亡作用。有研究證實50％肝癌組織PUMA蛋白表達(dá)高于周圍肝硬化組織，推測PUMA蛋白表達(dá)可能與肝癌的進(jìn)展有關(guān)，但PUMA在肝癌中具體作用及其機制卻并不清楚。本文通過細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)探討PUMA在肝癌中的作用及其調(diào)控機制。
　　方法：
　　收集36例手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌和相應(yīng)無瘤肝組織標(biāo)本，用免疫組織化學(xué)方法檢測肝癌和相應(yīng)無瘤肝組織中NFκB和PUMA的表達(dá)，用ELISA測定組織中HBx

6、的濃度，分析其與肝癌臨床病例特征間的關(guān)系。不同p53狀態(tài)的BEL-7402肝癌細(xì)胞和Huh-7肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染攜帶野生型HBx基因質(zhì)粒，用RT-PCR檢測NFκB的mRNA，western blot檢測肝癌細(xì)胞中HBx、p53、NFκB、PUMA蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　在肝細(xì)胞肝癌和相應(yīng)無瘤肝組織中，NFκB為胞核和胞漿表達(dá)，55.5％(20/36)的病例肝癌組織中NFκB表達(dá)高于無瘤肝組織，25.0％(9/36)的病例肝癌

7、組織中NFκB表達(dá)低于無瘤肝組織;PUMA蛋白為胞漿表達(dá)，61.1％(22/36)的病例肝癌組織中PUMA表達(dá)高于無瘤肝組織，11.1％11.1％(4/36)的病例肝癌組織中PUMA表達(dá)低于無瘤肝組織。肝癌組織NFκB表達(dá)與感染肝炎類型、病毒載量、血清α-FP水平、腫瘤大小、肝癌分期、腫瘤分化程度、復(fù)發(fā)高危因素沒有相關(guān)性;在Ⅱ、Ⅲ期肝癌或有復(fù)發(fā)高危因素的肝癌中，癌組織PUMA表達(dá)低于相應(yīng)無瘤組織(P=0.020，0.004);在有復(fù)發(fā)高

8、危因素組，癌組織PUMA表達(dá)接近無瘤肝組織，而無復(fù)發(fā)高危因素的肝癌組，PUMA表達(dá)是無瘤肝組織1.74倍（P=0.018）。肝癌組織中HBx蛋白和NFκB表達(dá)的相關(guān)系數(shù)r=0.88(P=0.000)，NFκB和PUMA蛋白表達(dá)有相關(guān)性（P=0.008）。
　　BEL-7402和Huh-7肝癌細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染HBx后，不論p53基因狀態(tài)如何，NFκBmRNA表達(dá)和NFκB蛋白表達(dá)上升、p53蛋白水平下降，同時PUMA蛋白下降。當(dāng)用PDT

9、C抑制NFκB表達(dá)后，在具有野生型p53的BEL-7402肝癌細(xì)胞出現(xiàn)p53和PUMA蛋白水平同步上升，并且隨著PDTC濃度的加大、對NFκB的抑制越明顯，p53和PUMA蛋白水平上升也越明顯;而在突變型p53的Huh-7肝癌細(xì)胞雖然p53蛋白水平上升，但PUMA蛋白并沒有同步上升。
　　結(jié)論：
　　肝癌中PUMA表達(dá)與肝癌分期、復(fù)發(fā)高危因素相關(guān)，其表達(dá)下降可能是促進(jìn)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機制之一。HBx在肝細(xì)胞癌中抑制p53的表達(dá)