HBx蛋白通過調(diào)控原代小鼠肝細(xì)胞周期促進(jìn)HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)編碼的HBx蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，它與HBV復(fù)制水平和IBV相關(guān)性原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但其具體調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。目前研究發(fā)現(xiàn)在永生化和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中，有效的HBV復(fù)制依賴于HBx蛋白，其中HBx蛋白的羧基端具有關(guān)鍵作用。但在正常肝細(xì)胞中，HBx通過何種途徑調(diào)控HBV的復(fù)制、如何影響細(xì)胞

2、增殖途徑以及其作用的確切功能區(qū)尚不清楚。本課題以正常原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞為研究對象，探討HBx蛋白及其截短體對細(xì)胞周期和HBV復(fù)制水平的影響及其相互關(guān)系，并確認(rèn)HBx發(fā)揮上述作用的主要功能區(qū)，以揭示HBx蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期和HBV復(fù)制的分子機(jī)制。
　　方法：
　　(1)運用改良的原位兩步膠原酶灌流法對C57BL/6小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行分離純化，采用含多種添加物的無血清WME培養(yǎng)基對小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，過碘酸雪夫氏(Period

3、ic acid-Schiff's，PAS)染色、生化法鑒定肝細(xì)胞的功能和分化特性，免疫蛋白印跡(Western blot)法檢測新鮮分離和原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的細(xì)胞周期標(biāo)志物p16、p21、cyclinD1、cyclin E、cyclinA的表達(dá)水平。
　　(2)利用HBx及其截短體表達(dá)質(zhì)粒pSI-HA-X、pSI-HA-X1-101、pSI-HA-X43-154，瞬時轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，免疫沉淀(immunoprecipitati

4、on，IP)/Western blot法檢測HBx蛋白表達(dá)水平。Western blot法檢測細(xì)胞上述周期標(biāo)志物表達(dá)水平。
　　(3)利用編碼HBV全基因組1.2倍體(payw1.2)的pGEM-HBV質(zhì)粒和HBx缺失突變的相同質(zhì)粒pGEM-HBV△X瞬時轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，將pSI-HA-X、pSI-HA-X1-101、pSI-HA-X43-154分別與pGEM-HBV△X共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，IP/Western blot法檢測HB

5、x蛋白表達(dá)水平，Western blot法檢測細(xì)胞上述周期標(biāo)志物及HBV編碼蛋白HBc的表達(dá)，Southern印跡雜交(Southern blot)及實時熒光定量PCR檢測HBV復(fù)制水平。
　　(4)利用特異性沉默p53基因的miRNA干擾質(zhì)粒分別與pGEM-HBV和pGEM-HBV△X共轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，IP/Western blot法鑒定p53沉默效率，Western blot法檢測細(xì)胞上述周期標(biāo)志物及HBV編碼的HBc

6、蛋白的表達(dá)，Southern印跡雜交(Southern blot)和實時熒光定量PCR法檢測HBV復(fù)制水平。
　　結(jié)果：
　　(1)原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞能保持合成白蛋白、尿素、糖原的肝臟特異性功能和分化特性，并能維持與新鮮分離肝細(xì)胞相同的靜息細(xì)胞周期(GO期)狀態(tài)。
　　(2)在轉(zhuǎn)染后原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞中IP/Western blot法能檢測到全長HBx蛋白及其羧基端截短體HBx1-101、氨基端截短體HBx43-15

7、4的表達(dá)，全長HBx與HBx43-154的表達(dá)水平相當(dāng)，而HBx1-101的表達(dá)水平明顯低于前兩者。全長HBx與HBx43-154能下調(diào)p16的表達(dá)水平，上調(diào)p21、cyclin D、cyclin E的表達(dá)水平，對cyclin A的表達(dá)水平無影響，HBx1-101對上述細(xì)胞周期標(biāo)志物的表達(dá)水平均無影響。在增加pSI-HA-X1-101質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量以提高HBx1-101蛋白表達(dá)水平之后，對細(xì)胞周期標(biāo)志物的表達(dá)仍無影響。
　　(3)與p

8、GEM-HBV△X組細(xì)胞相比，pGEM-HBV組細(xì)胞內(nèi)p16的表達(dá)下調(diào)，p21、cyclin D、cyclin E的表達(dá)上調(diào)，cyclin A的表達(dá)水平無明顯變化，且核心顆粒HBV DNA水平明顯高于pGEM-HBV△X組細(xì)胞。分別以全長HBx和HBx43-154重建pGEM-HBV△X缺失的HBx蛋白表達(dá)之后，其各項細(xì)胞周期標(biāo)志物的表達(dá)和核心顆粒HBV DNA均能夠恢復(fù)到與pGEM-HBV組細(xì)胞相似的水平，但即使增加pSI-HA-X1

9、-101質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量以使HBx1-101蛋白表達(dá)水平與全長HBx和HBx43-154相當(dāng)，pGEM-HBV△X組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期標(biāo)志物的水平和核心顆粒HBV DNA水平仍然沒有明顯改變。HBV編碼的HBc蛋白水平在各組細(xì)胞中一致。
　　(4)轉(zhuǎn)染pGEM-HBV△X的細(xì)胞中，沉默p53基因的表達(dá)使p16表達(dá)下調(diào)，cyclin D1、cyclin E、cyclin A表達(dá)上調(diào)，對p21的表達(dá)水平無影響，并能使其核心顆粒HBV DNA水平

10、上升，但不能達(dá)到與pGEM-HBV組細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃健＾D(zhuǎn)染pGEM-HBV的細(xì)胞中，沉默p53基因的表達(dá)對其細(xì)胞周期標(biāo)志物水平及核心顆粒HBV DNA水平均無明顯影響。HBV編碼的HBc蛋白水平在各組細(xì)胞一致。
　　結(jié)論：在保持靜息細(xì)胞周期狀態(tài)的原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞中，HBx蛋白通過下調(diào)p16的表達(dá)，上調(diào)cyclin D、cyclin E的表達(dá)，使細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期，且通過上調(diào)p21的表達(dá)，使細(xì)胞停滯在G1期，并由此促進(jìn)HBV的復(fù)