VEGF-B與prelamin A相互作用關(guān)系的進(jìn)一步驗(yàn)證及其功能的初步研究.pdf

1、目的：細(xì)胞衰老是個(gè)復(fù)雜而漸進(jìn)的過(guò)程，可以分為兩類，一類為復(fù)制性衰老，即有基本的代謝能力，但沒(méi)有分化能力；另一類為早老，即永久的、不可逆轉(zhuǎn)的增殖停滯。A型核纖層蛋白前體(prelamin A)的加工異常，導(dǎo)致早老癥(HGPS)的出現(xiàn)，推測(cè)prelaminA及其結(jié)合蛋白可能在細(xì)胞衰老過(guò)程中起著重要作用。人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B(VEGF-B)是一種近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族的新成員，為本課題組前期通過(guò)酵母雙雜交篩選出的與prelaminA

2、相互作用的蛋白之一，其結(jié)構(gòu)與VEGF較為相似，并選擇性與VEGF的受體之一VEGFR-1結(jié)合。VEGF-B參與血管生成，神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)，胚胎發(fā)育等生理過(guò)程以及一些退行性疾病的病理過(guò)程。本課題組前期已通過(guò)熒光共定位和GST pull-down等實(shí)驗(yàn)，初步證明了VEGF-B是prelamin A的一個(gè)相互作用的蛋白。本研究進(jìn)一步通過(guò)提取細(xì)胞核、細(xì)胞漿蛋白，確定VEGF-B蛋白在HEK-293細(xì)胞中的表達(dá)定位；通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)證明VEGF-

3、B與prelamin A在細(xì)胞內(nèi)的相互作用；采用RNAi技術(shù)初步探討VEGF-B在細(xì)胞衰老中的作用。
　　 方法：構(gòu)建真核表達(dá)載體pDsRed1-N1-PLA質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293細(xì)胞(HEK-293)，通過(guò)Western blotting檢測(cè)VEGF-B在HEK-293PLA細(xì)胞中的表達(dá)定位；構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-MYC-PLA，將pCMV-MYC-PLA和pCMV-HA-VEGF-B質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)

4、胞，進(jìn)行免疫共沉淀。采用QRT-PCR技術(shù)檢測(cè)VEGF-B在HEK-293和HEK-293PLA細(xì)胞中mRNA的表達(dá)情況；通過(guò)RNAi技術(shù)觀察VEGF-B蛋白在HKE-293細(xì)胞中對(duì)衰老細(xì)胞的影響。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pDsRed1-N1-PLA質(zhì)粒，Western blotting顯示VEGF-B在HEK-293PLA細(xì)胞中表達(dá)定位在細(xì)胞核；通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)，證明了VEGF-B和prelamin A在HEK-2