RanBPM與prelamin A相互作用的驗(yàn)證和RanBPM功能的初步研究.pdf

1、[目的]A型核纖層蛋白前體(prelaminA)加工成熟出現(xiàn)異常則導(dǎo)致兒童早老癥(HGPS)的出現(xiàn),HGPS患者中細(xì)胞胞核結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)不同程度的異常,包括特征性的核畸形、DNA損傷加重、某些核蛋白表達(dá)下調(diào)等。在正常衰老的老年個(gè)體皮膚成纖維細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有類似于HGPS患者細(xì)胞胞核畸變的現(xiàn)象。推測(cè)prelamin A及其相互作用蛋白在HGPS患者和人體生理性衰老過程中均發(fā)揮著重要作用。RanBPM(RanBP9,Ran Binding P

2、rotein in the Microtubule-OrganizingCenter)因在中心體參與微管的成核過程而命名,在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)而又高度保守,參與微管的動(dòng)態(tài)變化、細(xì)胞遷移、核運(yùn)動(dòng)以及染色體的分離、蛋白與蛋白之間的相互作用等。本實(shí)驗(yàn)室前期工作通過酵母雙雜交技術(shù)初步證明RanBPM是一個(gè)與prelamin A相互作用的蛋白,本研究進(jìn)一步通過細(xì)胞外蛋白沉降實(shí)驗(yàn)(GST pull-down analysis)、免疫共沉淀(Co

3、-immunoprecipitation)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞內(nèi)定位等方法證明其與prelamin A在細(xì)胞內(nèi)外的相互作用,并初步探討該蛋白在細(xì)胞衰老中的作用。
　　 [方法]構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-RanBPM,分別進(jìn)行RanBPM和prelaminA的原核表達(dá),通過GST pull-down實(shí)驗(yàn)證明兩者在體外的相互作用;構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-RanBPM,將pCMV-myc-PLA和pEGFP-N1-RanBPM質(zhì)

4、粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。將構(gòu)建的pEGFP-N1-RanBPM和pDsRedl-N1-prelamin A融合表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293(HEK-293),熒光顯微鏡下觀察RanBPM與prelamin A共定位情況。采用RT-PCR等方法檢測(cè)RanBPM在HEK-293和HEK-293PLA細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄水平,從而初步探討RanBPM在衰老細(xì)胞中的作用。
　　 [結(jié)果]成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-

5、32a-RanBPM,通過GST pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了RanBPM和prelamin A在細(xì)胞外有相互作用;成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-RanBPM,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步證明了RanBPM和prelaminA在HEK-293細(xì)胞內(nèi)有相互作用:細(xì)胞定位觀察結(jié)果表明RanBPM在細(xì)胞胞核和胞漿均有表達(dá),與prelamin A在HEK-293細(xì)胞核膜上共定位。PCR結(jié)果顯示RanBPM在HEK-293PLA細(xì)胞中mRN