LMCD1與Prelamin A相互作用的驗證及其與細胞衰老關(guān)系的初步研究.pdf

1、背景與目的：Hutchinson-Gilford progeria syndrome(HGPS)是一種罕見的加速兒童過早老化的致命性遺傳疾病，主要由A型核纖層蛋白(lamin A)突變蛋白progerin的異常堆積引起。Progerin在健康個體中也有表達，盡管水平較低且其表達水平并不隨年齡增長而改變。但由于progerin具有獲得性功能，因而它的存在可能人類正常衰老之間亦存在聯(lián)系。Prelamin A的異常堆積導(dǎo)致核纖層缺陷能夠引起廣

2、泛的衰老癥狀，這提示該過程很可能通過prelamin A相互作用蛋白來實現(xiàn)。異常堆積A型核纖層蛋白前體(prelamin A)的Zmpste24-/-小鼠顯示早老癥類似的形態(tài)和生理缺陷。
　　 LMCD1(Homo sapiens LIM and cysteine-rich domains1)是一種含有LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，該類蛋白家族成員主要參與和細胞骨架蛋白的相互作用，并引起相應(yīng)的生物學(xué)功能。本實驗室前期工作通過酵母雙雜交技

3、術(shù)初步證明LMCD1可能與prelamin A相互作用。本研究進一步通過細胞內(nèi)定位等方法證明其與prelamin A在細胞內(nèi)的相互作用；研究LMCD1在正常與早老細胞中的mRNA表達差異；利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，在HEK293細胞中過表達LMCD1，探討LMCD1對細胞衰老的影響。
　　 方法：構(gòu)建LMCD1的真核表達載體pEGFP-N1-LMCD1，將它與質(zhì)粒pDsRed1-N1-PLA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，在激光共聚焦顯微鏡

4、下觀察LMCD1與prelamin A共定位情況：采用RT-PCR和QPCR技術(shù)檢測LMCD1在HEK293和HEK293PLA細胞以及Zmpste24基因缺失小鼠胚胎成纖維細胞(Zmpste24-/-MEFs)及其對照野生型小鼠胚胎成纖維細胞(Zmpste24+/+MEFs)中mRNA的表達情況；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pEGFP-N1-LMCD1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎HEK293細胞，檢測細胞衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色，了解其對細胞衰老

5、的影響。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建真核表達載體pEGFP-N1-LMCD1。細胞定位觀察結(jié)果表明LMCD1在細胞胞核和胞漿均有表達，但主要定位在胞漿。LMCD1與prelamin A共轉(zhuǎn)染后，LMCD1與prelamin A在HEK293細胞核膜上共定位。QPCR結(jié)果顯示：與HEK293細胞相比，LMCD1在HEK293PLA細胞中mRNA的水平表達上調(diào)；將pEGFP-N1-LMCD1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，衰老的細胞數(shù)較轉(zhuǎn)