MicroRNA-200b-c對膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移及干細(xì)胞樣特性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下四個方面展開論述：
　　第一部分 膽管癌差異性microRNA的篩選及驗證
　　目的：篩選膽管癌及對應(yīng)癌旁組織中差異表達(dá)的microRNA，并擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證，初步判斷目標(biāo)microRNA在膽管癌組織中的表達(dá)情況，為下一步實驗選擇研究對象。
　　方法：采用MicroArray及表達(dá)譜芯片分析3對膽管癌及對應(yīng)癌旁組織中microRNA及mRNA的差異性表達(dá)，并對其進(jìn)行GO功能分析及pathway通路分析，

2、分析在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中可能涉及的位點(diǎn)及通路；通過實時定量PCR及Northern blot對擴(kuò)大樣本量的14對膽管癌及對應(yīng)癌旁組織的microRNA-200b/c表達(dá)水平進(jìn)行驗證。
　　結(jié)果：1.膽管癌組織差異性表達(dá)microRNA21條，其中過表達(dá)15條、低表達(dá)6條。GO分析及Pathway分析顯示microRNA-200家族在膽管癌中可能發(fā)揮重大影響。
　　2.microRNA-200b/c/429在14對膽管癌組織

3、中相對應(yīng)癌旁組織呈明顯的低表達(dá)，其中，microRNA-200b（p=0.038）和microRNA-200c（p=0.019）的低表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.microRNA-200b/c在12對膽管癌組織中驗證，呈明確低表達(dá)。
　　結(jié)論：1. microRNA-200b/c/429功能簇在膽管癌中呈顯著的低表達(dá)，其中microRNA-200b/c總體表達(dá)水平具有統(tǒng)計學(xué)意義，可作為下一步研究對象。
　　2.Rh

4、o/ROCK及細(xì)胞骨架通路在膽管癌中具有顯著差異，可作為后續(xù)機(jī)制研究參考。
　　第二部分 miR-200b/c對膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥特性的影響研究
　　目的：驗證miR-200b/c在體內(nèi)體外對膽管癌侵襲、轉(zhuǎn)移及化療敏感性的影響
　　方法：1.利用外源性化學(xué)合成miR-200b/c mimics/antagomir載體轉(zhuǎn)染人膽管癌細(xì)胞TFK-1、QBC939。轉(zhuǎn)染后利用Transwell實驗、劃痕實驗及CCK-8檢測對

5、膽管癌體外的侵襲轉(zhuǎn)移及對5-氟尿嘧啶化療敏感性的影響。
　　2.利用慢病毒載體miR-200b/c-U、miR-200b/c-D轉(zhuǎn)染人膽管癌細(xì)胞系TFK-1，并構(gòu)建裸鼠膽管癌脾臟轉(zhuǎn)移模型，利用MRI小鼠成像及肝臟病理切片檢測其對膽管癌體內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　結(jié)果：1.上調(diào)miR-200b/c表達(dá)可顯著降低膽管癌細(xì)胞系TFK-1、QBC939的體外侵襲、遷移能力，下調(diào)miR-200b/c表達(dá)可增加其侵襲、遷移能力。相對于

6、陰性對照組，實驗組結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.01）。
　　2.上調(diào)miR-200b/c表達(dá)可增加膽管癌細(xì)胞系TFK-1對5-氟尿嘧啶的化療敏感性，其24h、48h及72h實驗組IC50值較陰性對照組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.01）。3.上調(diào)miR-200b/c表達(dá)可減少膽管癌細(xì)胞系TFK-1在裸鼠膽管癌肝臟轉(zhuǎn)移模型中肝臟微轉(zhuǎn)移灶的形成，下調(diào)miR-200b/c表達(dá)可增加其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的形成。相對于陰性對照組，實驗組結(jié)果具有統(tǒng)計

7、學(xué)意義。
　　結(jié)論：1.miR-200b/c可增加膽管癌細(xì)胞系TFK-1對5-氟尿嘧啶的化療敏感性，可降低其體外侵襲、遷移能力
　　2.miR-200b/c可減少裸鼠體內(nèi)膽管癌模型中肝臟遠(yuǎn)處微轉(zhuǎn)移灶的形成。
　　第三部分 miR-200b/c對膽管癌干細(xì)胞特性的影響研究
　　目的：驗證miR-200b/c在體內(nèi)體外對膽管癌皮下成瘤、克隆球形成、分化及干細(xì)胞表面標(biāo)志物的影響
　　方法：1.對慢病毒載體干預(yù)后的

8、膽管癌細(xì)胞TFK-1進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實驗，明確其對膽管癌細(xì)胞成瘤能力的影響。
　　2.利用克隆球形成實驗對慢病毒載體干預(yù)后的膽管癌細(xì)胞TFK-1進(jìn)行檢測，并利用分化實驗檢測其內(nèi)源性miR-200b/c的表達(dá)水平變化。
　　3.利用流式細(xì)胞術(shù)對外源性miR-200b/c干預(yù)后的TFK-1細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測，明確其對膽管癌干細(xì)胞比例的影響。
　　結(jié)果：1.外源性miR-200b/c可降低TFK-1皮下成瘤能力，

9、抑制miR-200b/c表達(dá)可增加其成瘤能力。相對于陰性對照組，實驗組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.01）。
　　2.外源性miR-200b/c可降低TFK-1克隆球形成能力，抑制miR-200b/c表達(dá)可增加其成球能力。內(nèi)源性miR-200b/c表達(dá)水平與分化程度呈負(fù)相關(guān)。相對于陰性對照組，實驗組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.01）。
　　3.外源性miR-200b/c可降低TFK-1表面CD133表達(dá)水平，但對CD24、

10、CD44表達(dá)水平無影響。抑制miR-200b/c表達(dá)可增加其表達(dá)。相對于陰性對照組，實驗組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.01）。
　　結(jié)論：1.miR-200b/c可影響 TFK-1細(xì)胞皮下成瘤、克隆球形成能力，TFK-1細(xì)胞內(nèi)源性miR-200b/c表達(dá)水平與分化程度呈負(fù)相關(guān)。
　　2.miR-200b/c可影響TFK-1細(xì)胞表面CD133表達(dá)率，但對CD24、CD44表達(dá)率無影響。
　　第四部分 miR-200b/

11、c對膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移及干細(xì)胞特性的調(diào)節(jié)作用位點(diǎn)及其機(jī)制研究
　　目的：驗證miR-200b/c對膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移及干細(xì)胞特性影響的作用靶點(diǎn)及其上下游通路；闡明miR-200b/c作用靶基因的生物學(xué)功能
　　方法：1.TargetScan預(yù)測miR-200b/c在膽管癌中可能的靶基因；利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染后預(yù)測靶基因的蛋白水平的表達(dá)變化。
　　2.利用Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測預(yù)測靶基因在膽

12、管癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。
　　3.構(gòu)建雙熒光素酶報告基因，驗證miR-200b/c與靶基因的結(jié)合情況。4.利用小干擾RNA對靶基因進(jìn)行功能學(xué)上的驗證。
　　結(jié)果：1.確定并驗證SUZ12、ROCK2是miR-200b/c的靶基因，miR-200b/c可直接結(jié)合于SUZ12、ROCK2的3’非翻譯區(qū)，抑制其蛋白質(zhì)水平的的合成。
　　2.SUZ12、ROCK2的蛋白水平在膽管癌組織呈明顯低表達(dá)，基因水平的表達(dá)無明顯的差

13、異性。
　　3.miR-200b/c通過抑制ROCK2，進(jìn)而影響其下游LIMK-Cofilin通路影響膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　4.miR-200b/c通過SUZ12影響膽管癌干細(xì)胞特性。
　　結(jié)論：1. miR-200b/c可直接作用于SUZ12、ROCK2發(fā)揮效應(yīng)。
　　2.miR-200b/c-ROCK2-LIMK-Cofilin通路對膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響與經(jīng)典的EMT途徑即ZEB1/2-E-Cadherin