CDC42過表達在膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移機制中的作用實驗研究.pdf

1、背景：膽管細胞癌是相對比較常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤之一，隨著醫(yī)學科學的發(fā)展，近年來該腫瘤診斷、發(fā)現(xiàn)率不斷提高，特別是肝外膽管細胞癌提高最為明顯。作為消化道的實體性惡性腫瘤，其典型的生物學表現(xiàn)主要是原位膨脹及浸潤生長，侵襲轉(zhuǎn)移是其主要的致死原因，外科干預性治療是目前主要的治療方式，但不能保證膽管癌的遠處、淋巴結(jié)及微小轉(zhuǎn)移灶的徹底根除，術后出現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移難以避免，此情況嚴重制約了膽管癌的手術切除效果及預后評估，通過對膽管細胞癌的深入認識，可

2、以針對膽管癌患者提出一個綜合性的治療方案，并根據(jù)患者的具體病理特點來判斷預后，而這些都需要技術和理論的支持。
　　前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)，67 LR蛋白過表達的膽管癌細胞株（QBC939、RBE）其突觸形成明顯多于正常的膽管上皮細胞，且在mRNA水平其表達水平亦明顯增高。67 LR是一種非整合素受體，多表達于消化道上皮細胞表面，一些研究表明其參與細胞與基底膜以及細胞外基質(zhì)的粘附功能。另外研究表明多種組織的惡性腫瘤中67LR表達增高，并

3、通過多種機制促進癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。本實驗室前期實驗已發(fā)現(xiàn)膽管細胞癌中67LR過表達，顯著促進癌細胞侵襲。猜想在67LR高表達細胞株中出現(xiàn)的突觸形成增多，是否為67LR過表達促進了突觸形成或啟動，直接或間接的激活了突觸形成的信號分子。
　　在腫瘤細胞中，突觸形成是與Rho GTP酶密切相關的。RHO GTP酶是一類Ras相關的信號分子，在腫瘤中可出現(xiàn)異常的激活或抑制。Rho GTP酶可以將 GDP偶聯(lián)去活化為GTP形式，活性形式可以結(jié)

4、合一定數(shù)量的效應分子，信號級聯(lián)放大，從而調(diào)控各種細胞過程。Rho其家族成員主要包括有RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2、Rac4、Cdc42等多個分子，該族成員分子為細胞內(nèi)重要的信號中間參與分子，例如 RhoA誘導張力纖維的形成，Racl誘導細胞板狀偽足和細胞膜皺壁的形成，Cdc42是Rho家族蛋白(RhoGTPase)中的重要成員之一，主要參與細胞侵襲足的形成等，并可通過參與激活下游的信號分子及效應分子產(chǎn)生一系列的生物學

5、反應，從而調(diào)控細胞的骨架重構(gòu)及細胞極性的變化。近年研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族分子與不同的組織來源所起到的作用不同，在某些惡性腫瘤的（乳腺癌、頭頸部腫瘤等）出現(xiàn)Cdc42的高表達情況，而在某些肝臟病變及血液系統(tǒng)腫瘤中出現(xiàn)Cdc42低表達的表型。將針對67LR過表達的出現(xiàn)的體外細胞株突觸（侵襲足）增多情況，研究Cdc42在膽管細胞癌中表達模式情況如何。67LR過表達是否通過影響Cdc42，進而促進膽管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　目的：應用免疫組織

6、化學（IHC）、Real-Time PCR、免疫熒光、WesternBlot方法從組織蛋白和mRNA水平檢測Cdc42蛋白的表達水平，探討在臨床上明確診斷的膽管細胞癌中 Cdc42的表達水平與患者臨床病理參數(shù)的相關性以及Cdc42在膽管癌患者預后評估中的作用和意義。并研究67LR過表達調(diào)控Cdc42影響膽管癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移的可能機制。
　　材料方法：
　　1.根據(jù)免疫組化染色的陽性細胞數(shù)目以及染色強度對 Cdc42的表達量進

7、行半定量分析，采用免疫組化染色的方法對87例膽管癌標本、23例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和18例遠處轉(zhuǎn)移灶標本（2005-2010行膽管癌手術治療患者標本），并對比淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶中Cdc42的表達差異。
　　2. Cdc42蛋白表達量與膽管癌臨床病理參數(shù)相關性分析，Cdc42表達量與膽管癌患者生存率的相關性采用Kaplan-Meier法分析并用log-rank檢測；采用Cox多元線性回歸分析所有涉及的臨床病理指標，評估其對膽管癌

8、患者總生存時間和無瘤生存時間的影響。
　　3.構(gòu)建 Cdc42干擾和過表達載體，轉(zhuǎn)染膽管癌細胞株(QBC939和 RBE)，干預Cdc42表達；通過劃痕實驗、Transwell侵襲實驗，研究Cdc42對膽管癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　4.采用免疫組化觀察87例膽管癌組織中67LR的表達情況，分析67LR和Cdc42表達的相關性。構(gòu)建67LR干擾和過表達載體，轉(zhuǎn)染膽管癌細胞(QBC939和RBE)；通過real-t

9、ime PCR、western-blot實驗，研究膽管癌細胞中干預67LR表達對Cdc42表達的影響；采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗，研究膽管癌細胞中 Cdc42能否與67LR基因啟動子結(jié)合。通過 western-blot實驗，研究膽管癌細胞中干預67LR表達對活性Cdc42表達的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.明確診斷的膽管癌切除組織標本中（87例），34例癌組織(39％)呈現(xiàn)Cdc42胞漿染色陽性；而24例癌旁組織

10、Cdc42有4例呈陽性（17%），而其余染色陰性；提示膽管癌中存在 Cdc42異常高表達具有統(tǒng)計學意義。分析 Cdc42表達與患者臨床病理特性相關性提示：Cdc42陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移顯著相關，而與患者性別、年齡、原發(fā)灶TNM分級、組織分化程度無關。32例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，25例（78%）出現(xiàn) Cdc42染色陽性，陽性率顯著高于原發(fā)灶（39%）；18例遠處轉(zhuǎn)移灶中，13例（75%）呈Cdc42染色陽性，其陽性率也高于原發(fā)灶；這些

11、結(jié)果提示：膽管癌中Cdc42異常表達與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關。
　　2. Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示：Cdc42陽性表達的患者術后總存活時間顯著低于Cdc42陰性組患者；而其腫瘤復發(fā)顯著早于Cdc42陰性表達的患者。Cox模型分析提示：Cdc42異常表達是判斷病人術后存活時間和腫瘤復發(fā)時間的相對獨立危險因素。本部分結(jié)果提示：Cdc42異常表達可能是判斷膽管患者預后的潛在分子標志。
　　3.利用體外膽管癌細胞株（QBC93

12、9、RBE）免疫熒光檢測，觀察 Cdc42在兩株細胞間的差異，并通過劃痕實驗、Transwell侵襲實驗，得出 QBC939細胞株中干擾Cdc42表達顯著抑制癌細胞的侵襲和遷移能力；而RBE細胞株中過表達Cdc42明顯增強癌細胞的侵襲和遷移能力。本部分實驗提示：Cdc42過表達可能促進膽管癌細侵襲轉(zhuǎn)移。
　　4.明確診斷的膽管癌切除組織標本中（87例），35例(40%)呈現(xiàn)67LR膜染色陽性。卡方檢驗提示67LR表達與Cdc42表

13、達情況顯著相關。連續(xù)切片免疫組化發(fā)現(xiàn)：67LR和Cdc42在膽管癌組織的表達具有相對的一致性。
　　5.在體外膽管癌細胞株（QBC939）中干擾67LR的表達，Cdc42的mRNA和蛋白表達無明顯變化。在膽管癌細胞株（RBE）中上調(diào)67LR的表達，Cdc42的 mRNA和蛋白表達無明顯變化。ChIP實驗結(jié)果提示QBC939和 RBE細胞中 Cdc42與67LR基因啟動子區(qū)無結(jié)合。通過western blot檢測發(fā)現(xiàn)QBC939中干

14、擾67LR的表達，活性Cdc42的表達降低，RBE中上調(diào)67LR表達，活性Cdc42的表達增強。本部分結(jié)果提示膽管癌細胞株體外體外實驗中，67LR可能通過增強 Cdc42的活性形式的促進膽管癌的侵襲作用。
　　結(jié)論：
　　1.利用IHC、western blot、以及PCR等分子生物學研究手段發(fā)現(xiàn)Cdc42在膽管細胞癌中存在異常高表達。
　　2. Cdc42表達量與腫瘤的淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計學意義上的相關性；并與膽