Lrrc10蛋白表達載體的構(gòu)建及在心肌分化細胞中的表達研究.pdf

1、Lrrc10基因是采用EST介導(dǎo)的基因克隆和表達譜分析，成功克隆的一個在小鼠心臟特異表達的新基因，該基因cDNA全長為1410bp，定位于小鼠染色體10D2，無內(nèi)含子，其最大開放閱讀框編碼的假定蛋白有274氨基酸組成，含有7個亮氨酸重復(fù)繼續(xù)基序。Lrrc10基因是第一個被報道具有心臟特異性的LRR家族成員，目前的研究表明所有LRR蛋白的功能均與蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)，至少一半的LRR蛋白參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而人類的胚胎發(fā)育和很多疾病都與信號轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)通路密切關(guān)聯(lián)。該基因有可能成為藥物設(shè)計中特異性的、副作用小的靶標(biāo)，具有重要的理論和實際意義。因此，本文通過構(gòu)建Lrrc10原核表達載體以期獲得重組Lrrc10蛋白，為進一步的功能研究提供基礎(chǔ)，同時在研究胚胎癌細胞P19的體外心肌分化過程中Lrrc10基因表達，為探討Lrrc10與心肌發(fā)育的關(guān)系提供依據(jù)。 1.重組質(zhì)粒pET-Lrrc10的構(gòu)建和Lrrc10蛋白表達 方法：NcoI和BamHI雙酶切載體pMD18-T-L

3、rrc10，回收目的片段與經(jīng)同樣酶切后的表達載體pET-30a(+)連接，轉(zhuǎn)入E.colistrainDH5a，菌落PCR篩選陽性菌落，提取陽性菌質(zhì)粒并進行PCR和酶切鑒定;將重組子轉(zhuǎn)入E.colistrainBL21(DE3)，于37℃振蕩培養(yǎng)，利用1mmol/LIPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達。 結(jié)果：PCR鑒定和酶切鑒定的結(jié)果表明，成功構(gòu)建了融合表達載體并命名為pET-Lrrc10。轉(zhuǎn)入E.colistrainBL21(DE3)

4、進行目的蛋白的表達，獲得與預(yù)期分子量大小相一致的融合表達蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵體形式存在于宿主菌中，且IPTG誘導(dǎo)4小時時，目的蛋白表達量最大。 2.Lrrc10在分化心肌細胞中的表達研究 方法：DMSO誘導(dǎo)P19細胞分化，建立P19體外心肌發(fā)生模型，顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，以心肌特異性肌節(jié)肌球蛋白重鏈a-MHC和B-MHC作為心肌分化的標(biāo)志；提取未分化的P19細胞及分化2天、4天、6天、8天的P19細

5、胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板進行PCR，檢測Lrrc10的基因表達。 結(jié)果：顯微鏡觀察，部分細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化；RT-PCR結(jié)果顯示，在細胞分化6天時檢測到a-MHC基因表達，分化到8天時檢測到B-MHC開始基因表達，表明P19細胞體外心肌分化成功；P19細胞分化的第二天Lrrc10基因開始表達。 結(jié)論：成功構(gòu)建了融合表達載體pET-Lrrc10，并獲得與預(yù)期相一致的目的蛋白；Lrrc10在