侵染玉米的水稻黑條矮縮病毒遺傳變異及其致病途徑解析.pdf

1、玉米粗縮病(Maize rough dwarf disease，MRDD)是世界性的玉米病毒病害之一，在我國黃淮海夏玉米區(qū)發(fā)生尤為嚴重，主要病原為水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，由灰飛虱（Laodelphax striatellus，SBPH）介導(dǎo)以持久性傳播。解析我國玉米粗縮病病原RBSDV遺傳變異，及其在玉米中的致病途徑是玉米粗縮病抗性機理研究和抗病育種的重要內(nèi)容。本文

2、采集我國玉米粗縮病高發(fā)區(qū)的玉米和水稻病株，通過病毒基因組測序，分析了病毒的遺傳變異與進化;通過研究RBSDV侵染后玉米轉(zhuǎn)錄組、miRNA-靶基因的差異，解析可能的致病途徑，為玉米粗縮病抗性機理研究和抗病育種提供基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　1.分析來自2012-2014年9個地點玉米和水稻病株的RBSDV基因組區(qū)段S1-S10遺傳變異。(1)僅基因組區(qū)段S8存在9bp的缺失，其它區(qū)段均無插入或缺失突變;兩個堿基間突變占變異總數(shù)的9

3、3.73％-96.11％，轉(zhuǎn)換(transition，76.87％-85.92％)大于顛換(transversion，8.69％-17.43％)，其中嘧啶(U/C)間轉(zhuǎn)換最多，占47.72％-59.60％;核苷酸多樣性最高的S9（π=0.0626）極顯著（P＜0.01）高于最低的S4（π=0.0225）;來自山東濟南點的RBSDV基因組區(qū)段S9(π=0.0755)和S7(π=0.0391)核苷酸多樣性最高，而江蘇省南京和鹽城的S9(π=

4、0.0391)和S7(π=0.0090)區(qū)段核苷酸多樣性最低，差異達到極顯著水平(P＜0.01);玉米和水稻寄主間RBSDV基因組區(qū)段核苷酸多樣性差異不顯著(P＞0.05);2013年分離株S7序列核苷酸多樣性（π=0.0307）顯著高于2014年(π=0.0244)(P=0.0226)。(2)在S9和S7中分別檢測到3個和1個重組事件，重組事件發(fā)生在不同寄主和地點間。采用46個非重組的RBSDV分離物S9序列與23個GenBank數(shù)據(jù)

5、庫中的S9序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹?；赟9系統(tǒng)發(fā)育分析表明中國玉米粗縮病株的病毒分離物遺傳距離與RBSDV較近，與其它病毒(例如MRDV、MRCV或SRBSDV)遺傳距離較遠;基于S9和S7序列多樣性均將RBSDV劃分為兩個類群，S7群進一步劃分為兩個亞群，分群與寄主和年份無關(guān)。(3)在氨基酸水平，P5-2變異最大（平均每10個氨基酸存在一個變異），P2變異最?。ㄆ骄?5個氨基酸存在一個變異），同一基因組區(qū)段不同閱讀框(ORF)編碼蛋白的

6、氨基酸變異不一致。(4)預(yù)測RBSDV S1-S10基因組區(qū)段的保守區(qū)，針對每個序列的保守區(qū)域設(shè)計并構(gòu)建了針對不同靶位的RNAi載體。
　　2.采用49個S9序列和111個S7序列分析RBSDV的選擇響應(yīng)。S7（含有兩個ORF，分別表示為S7-1和S7-2）序列A+U含量豐富，且密碼子多以A-(A3s，S7-1:32.64％, S7-2:29.95％)或U-結(jié)尾(U3s，S7-1:44.18％，S7-2:46.06％);S7密碼子

7、偏性程度低(Nc, S7-1:45.63; S7-2:39.96)，突變是RBSDV-S7密碼子偏性的主要原因，且密碼子偏性與年份、寄主及地點無關(guān);在S7-1和S7-2中共檢測到12個最優(yōu)密碼子。S9(含有兩個ORF，分別表示為S9-1和S9-2)與S7的ORF均承受負向選擇或純化作用(Ka/Ks ratios:0.0179-0.0589);同一基因組區(qū)段不同ORF選擇壓力水平不同，S9-2承受的選擇壓力顯著高于S9-1(P＜0.01)

8、，S7-1承受的選擇壓力顯著高于S7-2(P＜0.01);同一ORF在年份間、寄主間和地點間承受的選擇壓力差異不顯著。RBSDV群體呈顯著擴增趨勢，在寄主、年份和部分地點間存在頻繁的遺傳交流。
　　3.采用組織超薄切片方法觀察玉米受RBSDV侵染后細胞組織形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)病毒主要存在于細胞質(zhì)和葉綠體中，病毒侵染后玉米韌皮部、細胞壁、葉綠體等均有明顯變化。利用RNA-seq技術(shù)對RBSDV侵染后的玉米轉(zhuǎn)錄組進行測序，顯示發(fā)病相關(guān)、細胞

9、壁相關(guān)、赤霉素相關(guān)、韌皮部相關(guān)、葉綠素相關(guān)和泛素相關(guān)基因表達量均存在顯著差異。鑒定出17個玉米miRNA家族中31個響應(yīng)RBSDV的miRNA成員，表達量差異均在2倍以上，其中17個呈上調(diào)表達，14個呈下調(diào)表達。采用降解組測序方法鑒定靶基因，發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集的細胞組件是細胞核和核糖體，主要功能是與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA模板和DNA結(jié)合有關(guān)，其次與金屬離子結(jié)合、水解酶活性、酸酐和磷等以及壓力響應(yīng)和光合作用有關(guān);靶基因多參與光合作用等新陳代謝途