人EGF-IL-18的表達(dá)優(yōu)化、表征鑒定及初步活性研究.pdf

1、目的:
　　 構(gòu)建EGF-IL-18融合基因的原核表達(dá)載體,運(yùn)用高密度發(fā)酵技術(shù)獲得高表達(dá)的EGF-IL-18蛋白,進(jìn)一步通過純化、復(fù)性獲得有活性的EGF-IL-18蛋白,為下一步動(dòng)物體內(nèi)生物學(xué)作用研究和臨床前新藥的開發(fā)打下基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.EGF-IL-18原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)采用PCR方法,以質(zhì)粒pFUS-EGF-IL-18為模板,擴(kuò)增EGF-IL-18融合基因并引入C12T、C21T、T24

2、C、A543T、C549T、T552C、A558G同義突變,將其克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET12a(+),構(gòu)建表達(dá)載體pET12a(+)-EGF-IL-18,限制性內(nèi)切酶雙酶切和測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。
　　 2.EGF-IL-18高密度發(fā)酵條件優(yōu)化以及純化復(fù)性針對(duì)發(fā)酵的pH、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、補(bǔ)料等

3、因素,在10L發(fā)酵罐水平的基礎(chǔ)上,采用正交設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化發(fā)酵條件。離心收集發(fā)酵菌液,壓力破碎儀破碎細(xì)胞獲得目的蛋白包涵體,采用2M尿素洗滌包涵體,8M尿素溶解包涵體,S-100和DEAE-SFF兩步法純化復(fù)性目的蛋白,冰凍干燥保存目的蛋白。
　　 3.EGF-IL-18蛋白表征鑒定及活性檢測(cè)將純化復(fù)性的融合蛋白EGF-IL-18標(biāo)記熒光染料Cy3,通過受體配體免疫熒光法檢測(cè)EGF-IL-18和腫瘤細(xì)胞表面EGFR結(jié)合。融合蛋白E

4、GF-IL-18與人白血病細(xì)胞(KG-1)共培養(yǎng)24 h,ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌水平來初步評(píng)價(jià)EGF-IL-18融合蛋白的復(fù)性效果和生物學(xué)活性；融合蛋白EGF-IL-18以系列梯度濃度作用于NK-92細(xì)胞,CCK-8試劑盒檢測(cè)NK-92細(xì)胞的增殖水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)雙酶切分析、PCR鑒定以及測(cè)序結(jié)果表明原核表達(dá)載體pET12a(+)-EGF-IL-18同設(shè)計(jì)相符；工

5、程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET12a(+)-EGF-IL-18誘導(dǎo)表達(dá)后,在分子量為21kDa處可產(chǎn)生特異的表達(dá)條帶,并能夠被抗人IL-18單克隆抗體所識(shí)別,與預(yù)期一致；C12T、C21T、T24C、A543T、C549T、T552C、A558G突變有利于EGF-IL-18蛋白表達(dá)。
　　 2.EGF-IL-18高密度發(fā)酵條件優(yōu)化以及純化復(fù)性 EGF-IL-18融合蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá),確定高密度發(fā)酵

6、工藝優(yōu)化條件:pH為7.0,誘導(dǎo)溫度為30℃,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600=1,補(bǔ)料開始時(shí)間為4h。各批次發(fā)酵中,最高獲得濕菌重69.9g/l,通過S-100分子篩和DEAE陰離子交換柱兩步法純化復(fù)性后每升發(fā)酵液最終獲得561mg純度大于90％的EGF-IL-18融合蛋白。
　　 3.EGF-IL-18蛋白表征鑒定及活性檢測(cè)激光共聚焦顯示EGF-IL-18和A431細(xì)胞表面的EGFR特異性結(jié)合:IFN-γ ELISA結(jié)果顯示,EGF-I