MASP-2 EGF和SP功能區(qū)抗體制備及初步鑒定.pdf

1、近年來(lái)，關(guān)于天然免疫識(shí)別學(xué)說——模式識(shí)別理論的提出推動(dòng)了免疫學(xué)的發(fā)展。模式識(shí)別受體-病原體相關(guān)分子模式(PRR-PAMP)的研究引起高度關(guān)注。甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)是重要的PRR之一，在固有免疫中扮演重要角色。當(dāng)MBL識(shí)別病原體時(shí)，其下游的蛋白酶MASP-2(mannose-binding lectin associated serine protease-2)通過裂解絲氨酸蛋白酶域N端的精氨酸-異亮氨酸間的肽鍵發(fā)生自激活作用，在

2、補(bǔ)體激活的凝集素途徑中發(fā)揮重要作用。另有研究表明，MASP-2與腫瘤，感染性疾病和自身免疫性疾病有關(guān)。因此，對(duì)MASP-2的研究已成為研究天然免疫的熱點(diǎn)之一。MASP-2由6個(gè)功能區(qū)組成，其中EGF功能區(qū)含Ca2+結(jié)合模體，SP功能區(qū)具有較高的激活凝血酶能力，參與MASP-2的自激活。本課題擬在構(gòu)建構(gòu)建MASP-2 EGF和SP原核表達(dá)載體重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，在異丙基硫代半乳糖苷的作用下進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，純化后免疫小鼠制備多克隆抗體，以

3、期為為后續(xù)檢測(cè)體液MASP-2含量、分析不同細(xì)胞MASP-2表達(dá)情況奠定基礎(chǔ)。
　　首先從胎肝提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后以此為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到特異性EGF、SP基因，采用酚-氯仿抽提法提純PCR產(chǎn)物，對(duì)EGF、SP片段和pGEX-6p-2質(zhì)粒進(jìn)行BamH(I)、Not(I)雙酶切，凝膠回收各片段，以T4 DNA連接酶分別連接EGF和SP片段酶切產(chǎn)物與pGEX-6P-2載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。采用熱休克法分別將EGF、

4、SP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化導(dǎo)入E.coli BL21感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化后菌液直接涂布于LB固體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。采用針對(duì)pGEX-6p-2質(zhì)粒通用引物的菌落PCR初篩LB平板上生長(zhǎng)的單克隆菌落，將陽(yáng)性擴(kuò)增的單克隆接種于LB液體選擇培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒為模板，以載體通用引物分別和EGF、SP目的片段的特異引物進(jìn)行cross-PCR鑒定，并同時(shí)進(jìn)行amH(I)、Not(I)雙酶切鑒定。Cross-PCR擴(kuò)增陽(yáng)性和雙酶切鑒定均正確的質(zhì)粒進(jìn)行DN

5、A序列測(cè)定鑒定重組質(zhì)粒正確性。序列測(cè)定結(jié)果與GenBank公布的masp-2EGF和SP標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)完全一致，且沒有發(fā)現(xiàn)移碼現(xiàn)象，說明成功構(gòu)建pGEX-6P-2-EGF、pGEX-6P-2-SP原核表達(dá)重組體。
　　確定重組表達(dá)載體成功構(gòu)建后，轉(zhuǎn)化pGEX-6P-2-EGF和pGEX-6P-2-SP重組載體于E.coli BL21感受態(tài)細(xì)菌，將菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后挑取單個(gè)菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜;次日擴(kuò)大培

6、養(yǎng)一定時(shí)間加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，低溫離心并洗滌菌體沉淀后，再次低溫離心棄上清收集菌體;超聲裂解所獲菌體，分別收集上清和沉淀，制樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)染色后分析蛋白表達(dá)形式，GST-EGF融合蛋白在上清表達(dá)，為可溶性蛋白;而SP融合蛋白只以包涵體形式存在，經(jīng)尿素處理后，純化GST-EGF和GST-SP融合蛋白。
　　最后分別用純化的GST-EGF和GST-SP融合蛋白免疫6～7周齡BALB/c小鼠，免疫完成后取小鼠血清

7、分別檢測(cè)其抗體特異性和效價(jià)。大量誘導(dǎo)GST-EGF和GST-SP融合蛋白，分別于第0、21、35天對(duì)小鼠進(jìn)行三次腹腔注射免疫，并設(shè)置對(duì)照組，末次免疫7天后取血，分離并保存血清，Western blotting檢測(cè)血清EGF、SP抗體特異性，間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清中EGF、SP抗體水平;EGF鼠抗血清效價(jià)達(dá)1∶32000，SP鼠抗血清效價(jià)達(dá)1∶40000，WB結(jié)果顯示融合蛋白組小鼠血清稀釋1000倍后仍有特異性目的條