日本血吸蟲P14基因納米微球-DNA疫苗的初步研究.pdf

1、目的:pcDNA3.1(+)-SjP14真核表達(dá)載體的提取及鑒定,并利用重組質(zhì)粒和納米微球-DNA疫苗免疫小鼠,探討其對(duì)小鼠血吸蟲感染的保護(hù)作用和納米微球的增強(qiáng)作用。
　　方法:1.pcDNA3.1(+)-SjP14真核表達(dá)載體的提取和鑒定:從重組質(zhì)粒菌株中提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定,利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞,RT-PCR和Westernblotting檢測(cè)其體外表達(dá),以驗(yàn)證其能表達(dá)出重組蛋白。2.DNA疫苗的制備及保護(hù)作用

2、研究:制備無(wú)內(nèi)毒素DNA疫苗及納米微球-DNA疫苗,用于免疫小鼠。將雌性BALB/c小鼠(6-8周齡,體重18-22g)隨機(jī)分為3組,每組10只,分別為生理鹽水對(duì)照組、pcDNA3.1(+)-SjP14組及納米微球-DNA疫苗組。各組小鼠分別肌肉注射100μg/鼠/次,每2周免疫一次,共3次。末次免疫后2周,經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴(30±1)條/鼠。尾蚴攻擊6w后用頸椎脫臼法處死小鼠,收集成蟲,計(jì)算減蟲率;同時(shí)留取肝臟,部分消化后

3、在顯微鏡下行蟲卵計(jì)數(shù),計(jì)算減卵率,部分肝臟用于組織病理學(xué)分析(HE染色法),觀察肝細(xì)胞變化及肉芽腫情況。
　　結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)成功提取了pcDNA3.1(+)-SjP14重組質(zhì)粒,進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切,得到一個(gè)大小與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一致的插入片段;純化上述質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞,經(jīng)新霉素篩選得出陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株,擴(kuò)大培養(yǎng)。RT-PCR和Westernblotting結(jié)果顯示,兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞內(nèi)均可表達(dá)。分別制備無(wú)內(nèi)

4、毒素pcDNA3.1(+)-SjP14和納米微球-DNA疫苗。以該疫苗免疫BALB/c小鼠,結(jié)果表明:pcDNA3.1(+)-SjP14p核酸疫苗能明顯提高小鼠的抗血吸蟲感染能力,減蟲率和減卵率分別達(dá)到44.6％和61.6%;納米微球-DNA疫苗免疫能進(jìn)一步提高小鼠抗血吸蟲感染作用,減蟲率和減卵率分別提高至56.2%和73.5%。大體解剖可見,生理鹽水組肝臟呈暗褐色,質(zhì)硬,表面可見彌漫性粟粒樣蟲卵結(jié)節(jié)分布,結(jié)節(jié)隆起密集,體積較大。pcD

5、NA3.1(+)-SjP14組小鼠肝臟色澤略帶暗紅色,質(zhì)地較軟,表面較光滑,隱約可見少量灰白色小點(diǎn),蟲卵結(jié)節(jié)較少;納米微球-DNA疫苗組,肝臟顏色呈鮮紅色,表面光滑,蟲卵結(jié)節(jié)少,質(zhì)軟。肝組織切片鏡下顯示,生理鹽水組小鼠肝組織中可見大量的蟲卵肉芽腫形成,肉芽腫體積較大,周圍有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),大量的肝細(xì)胞變性壞死,pcDNA3.1(+)-SjP14組肝臟病變較生理鹽水組明顯減輕,pcDNA3.1(+)-SjP14納米微球組肝臟損傷程度最輕,