日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjTNFR的初步研究.pdf

1、血吸蟲病是一種全球分布、影響較為嚴重的重要人獸共患病。目前可用治療藥物存在潛在抗性，同時缺乏有效的疫苗，使得新藥的開發(fā)顯得尤為重要。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種主要方式。日本血吸蟲細胞凋亡的深入研究可為篩選日本血吸蟲新藥靶提供新思路。本實驗通過對日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjTNFR的克隆、原核和真核表達、及該基因生物學(xué)功能的初步探討，為深入闡述日本血吸蟲的凋亡機制積累了知識，為評估SjTNFR作為血吸蟲病治療藥物靶標的潛力提供了基礎(chǔ)。<

2、br>　　1.日本血吸蟲凋亡相關(guān)基因SjTNFR的克隆表達及生物學(xué)特性分析
　　利用PCR技術(shù)擴增了日本血吸蟲SjTNFR的全長序列，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。序列分析表明該基因ORF含603bp，編碼200個氨基酸，理論分子量為22.3Da，理論等電點為7.6。生物信息學(xué)分析表明該基因不含有信號肽以及跨膜區(qū)序列。結(jié)構(gòu)域分析表明該基因編碼蛋白屬于TNFR超家族成員。構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET28a(+)-SjTNFR，并在大腸桿菌中成功表達。

3、Real-time PCR結(jié)果顯示該基因在大、小鼠來源14d、23d、32d、和42d四個不同發(fā)育階段蟲體均有表達，其中大鼠來源蟲體SjTNFR的表達水平在14d后都明顯高于小鼠來源蟲體，在感染后32d和42d表達差異更明顯（P<0.05）。提示該基因的差異表達可能是影響血吸蟲在大、小鼠不同適宜性宿主體內(nèi)生長發(fā)育的因素之一。
　　2. SjTNFR的真核表達及功能初步分析
　　通過PCR技術(shù)擴增到SjTNFR功能區(qū)片段，成功

4、構(gòu)建了真核重組表達質(zhì)粒pxj-40-SjTNFR，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細胞。細胞間接免疫熒光實驗顯示，轉(zhuǎn)染pxj-40-SjTNFR質(zhì)粒的293T細胞表達SjTNFR蛋白。Western blotting分析結(jié)果進一步證明了重組質(zhì)粒在293T細胞中成功表達，SjTNFR重組蛋白分子量大小約為26 kDa。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的細胞早期凋亡比例為25.3％，而對照組為2.73%，轉(zhuǎn)染組的細胞晚期凋亡比