日本血吸蟲熱休克蛋白70誘導(dǎo)小鼠先天免疫的初步研究.pdf

1、先前的研究表明，在輻照致弱(RA)血吸蟲免疫小鼠模型中，高保護性免疫效果是通過RA早期童蟲誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特征性的先天免疫，形成有利于保護性CD4+T細胞分化的獲得性免疫應(yīng)答環(huán)境;其中來源于早期童蟲的應(yīng)急分子如熱休克蛋白等可能發(fā)揮了重要作用。本研究旨在探索日本血吸蟲熱休克蛋白70(SjHSP70)在先天性免疫應(yīng)答中的功能作用，以期為深入闡明RA血吸蟲疫苗的保護機制奠定基礎(chǔ)。
　　1、SjHSP70誘導(dǎo)宿主巨噬細胞極化的研究。SjHSP

2、70與RAW264.7巨噬細胞共孵育24～48h，同時設(shè)置M1(LPS)、M2(IL-4)陽性對照組，Griess法檢測胞外NO含量，精氨酸酶活性檢測定量檢測精氨酸酶的含量，流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測巨噬細胞標志分子，RT-PCR檢測標志分子mRNA轉(zhuǎn)錄表達。Griess法結(jié)果顯示，SjHSP70能夠顯著促進巨噬細胞NO的分泌(P＜0.001);精氨酸酶活性檢測結(jié)果，精氨酸酶活性達到6.15U/L，顯著高于

3、對照組(P＜0.001);FCM結(jié)果顯示，SjHSP70刺激組M1型標志分子CD16/32和iNOS表達明顯上調(diào)，而M2型標志分子CD206沒有明顯變化;RT-PCR結(jié)果表明iNOS顯著上調(diào)(P＜0.05)，ArginaseⅠ表現(xiàn)上調(diào)(P＜0.01)，而CD206表現(xiàn)下調(diào)(P＜0.05)。提示SjHSP70可以誘導(dǎo)巨噬細胞極化，前期偏向于M1極化，共孵育48 h時偏向于M2極化。
　　2、分析SjHSP70誘導(dǎo)致敏小鼠淋巴細胞反應(yīng)

4、。小鼠用重組SjHSP70免疫致敏，驗證免疫原性后余下小鼠感染50條尾蚴飼喂42d。流式細胞術(shù)(FCM)檢測致敏小鼠和它們感染50條尾蚴42d后小鼠淋巴細胞中CD4+與CD8+T細胞的比值;SjHSP70刺激致敏淋巴細胞72 h后，MTT法檢測混合淋巴細胞增殖，F(xiàn)CM檢測淋巴細胞中CD4+T細胞因子表達，RT-PCR檢測淋巴細胞的細胞因子的表達。結(jié)果顯示，SjHSP70可以促進致敏淋巴細胞增殖，且增殖指數(shù)為2.59(SI＞2);SjHS

5、P70免疫組CD4+/CD8+T細胞的比值為2.83，顯著高于對照組2.46(P＜0.001);經(jīng)重組SjHSP70再刺激的致敏淋巴細胞的CD4+T細胞胞內(nèi)IL-4水平明顯高于PBS對照組;淋巴細胞細胞因子RT-PCR結(jié)果表明，SjHSP70免疫組IL-4、IL-10和TNF-α明顯上調(diào)(P＜0.05)，IFN-γ明顯下調(diào)(P＜0.01);感染尾蚴后CD4+/CD8+T比值為2.66相比不顯著。提示SjHSP70能夠誘導(dǎo)小鼠Th2型免疫

6、應(yīng)答。
　　3、探究SjHSP70活化小鼠DC的TLR2/TLR4信號途徑的分子機制。TLR2-/-敲除、TLR4-/-敲除和野生型C57BL/6J小鼠骨髓來源的DC用重組的SjHSP70刺激。掃描電鏡觀察細胞形態(tài)、FCM檢測DC表面TLR2和TLR4的表達、RT-PCR檢測DC細胞因子和IκBα在mRNA水平上的表達。結(jié)果顯示，在TLR2-/-敲除小鼠DC細胞表面觀察不到枝狀突起，而在TLR4-/-和野生型的小鼠DC細胞表面則可

7、觀察到明顯的樹突結(jié)構(gòu)，提示SjHSP70活化DC可能通過TLR2途徑;FCM結(jié)果表明TLR2途徑在DC活化中占主導(dǎo)地位;SjHSP70誘導(dǎo)DC經(jīng)TLR2途徑活化后，分泌的Th1炎性細胞因子IFN-γ減少，而IL-6和IL-1β分泌增加，提示這可能導(dǎo)致DC與CD4+T細胞作用的微環(huán)境偏向于Th2型;IκBα檢測結(jié)果表明SjHSP70活化DC可能依賴于NF-κB信號途徑。結(jié)果提示，SjHSP70活化DC的信號途徑可能以依賴于NF-κB的TL