西咪替丁對(duì)日本血吸蟲(chóng)DNA疫苗免疫保護(hù)作用的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、日本血吸蟲(chóng)病是一種廣泛流行并嚴(yán)重影響人畜健康的寄生蟲(chóng)病。我國(guó)目前對(duì)血吸蟲(chóng)病防治的重點(diǎn)在于滅螺及人畜同步化療。但是由于吡喹酮僅對(duì)侵入皮膚3 h的童蟲(chóng)和成蟲(chóng)有效，且目前在很多國(guó)家已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)吡喹酮敏感性降低的報(bào)道。因此，安全有效的疫苗對(duì)血吸蟲(chóng)病的防治具有重要的作用。日本血吸蟲(chóng)的疫苗研究經(jīng)歷了死疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗以及核酸疫苗等過(guò)程。其中核酸疫苗中最常用的是DNA疫苗，因其具有制備簡(jiǎn)單、保存及運(yùn)輸方便與能誘導(dǎo)廣泛和持久的體液免疫和細(xì)胞

2、免疫的優(yōu)點(diǎn)而備受研究者青睞。目前血吸蟲(chóng)DNA疫苗在血吸蟲(chóng)研究中占據(jù)著主導(dǎo)地位。但是截至目前為止，單價(jià)DNA疫苗的免疫保護(hù)效果并不令人滿(mǎn)意，WHO推薦的40％或以上保護(hù)力仍然沒(méi)有達(dá)到。究其原因在于，血吸蟲(chóng)作為一種多細(xì)胞生物，基因組非常復(fù)雜，且在與宿主長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中產(chǎn)生了多種免疫逃避機(jī)制。新近證實(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）與寄生蟲(chóng)逃避宿主免疫攻擊關(guān)系非常密切。在很多感染性疾病中，尤其是寄生蟲(chóng)感染時(shí)Tregs的水平顯著升高，從而成為了寄生

3、蟲(chóng)一個(gè)逃生的“窗口”幫助其逃避宿主的免疫攻擊。在瘧疾感染的小鼠模型中，消耗Tregs有利于機(jī)體清除病原體并降低小鼠出現(xiàn)致死性感染的可能。因此探究血吸蟲(chóng)感染中Tregs的變化，并針對(duì)該變化采取相應(yīng)的治療方案必將有助于血吸蟲(chóng)疫苗的研究。西咪替?。–IM）作為H2受體阻滯劑在臨床上一直用于治療胃酸引起的胃腸功能紊亂并有確定的療效。除此之外，CIM在臨床上還廣泛的用于治療皰疹病毒，HIV病毒等感染性疾病引起的免疫功能下降，以及阻抑腫瘤的發(fā)生及生

4、長(zhǎng)。研究表明，其作用機(jī)制主要在于抑制抑制性T細(xì)胞的功能從而發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。有報(bào)道稱(chēng)，直接將CIM和吡喹酮合用可顯著提高吡喹酮的殺蟲(chóng)效果。同時(shí)也有很多將CIM作為一種免疫調(diào)節(jié)劑來(lái)增強(qiáng)疫苗的免疫原性的報(bào)道。本研究選用CIM和日本血吸蟲(chóng)26KD谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Sj26）DNA疫苗合用，一方面觀察CIM和日本血吸蟲(chóng)pEGFP-Sj26GST DNA疫苗聯(lián)合使用的免疫保護(hù)作用；另一方面觀察CIM和日本血吸蟲(chóng)pEGFP-Sj26GST DNA

5、疫苗聯(lián)合使用后宿主體內(nèi)Tregs的變化，并探討其免疫機(jī)制。本研究分為以下三個(gè)部分：
　　 第一部分：西咪替丁對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠免疫應(yīng)答的影響研究。
　　 目的：探討不同劑量的CIM對(duì)血吸蟲(chóng)感染小鼠免疫應(yīng)答的影響。
　　 方法：32只6-8周齡的BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分成3組，即50 mg/kg CIM組（CIM50）、25mg/kg CIM組（CIM25）及感染對(duì)照組（Control）。CIM50組采用50

6、mg/kg的CIM皮下注射三次，每次間隔兩周；CIM25組采用25mg/kg的CIM皮下注射三次，每次間隔兩周，即第1、14、28天分別用藥一次；Control為單純感染組。第42天時(shí)各組小鼠攻擊感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴40條/鼠。感染后第6周殺鼠取脾淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+FoxP3+Tregs百分比及IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5水平。
　　 結(jié)果：和感染對(duì)照組相比，使用25mg/kg CIM組調(diào)

7、節(jié)性T細(xì)胞的比例顯著降低（P＜0.01）且小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ的水平均較對(duì)照組升高（P＜0.05），而IL-4、IL-5的水平較對(duì)照組則無(wú)顯著性差異（P> 0.05）。而和感染對(duì)照組相比，使用50mg/kg CIM組在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例及小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的水平上均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P> 0.05）。
　　 結(jié)論：CIM可作為免疫調(diào)節(jié)劑，增強(qiáng)小鼠的免疫功能，從而提高小鼠對(duì)血吸蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)作用

8、，但是該作用與劑量有關(guān)。
　　 第二部分：西咪替丁和日本血吸蟲(chóng)pEGFP-Sj26GST DNA疫苗聯(lián)合使用的免疫保護(hù)作用研究。
　　 目的：觀察CIM對(duì)pEGFP-Sj26GST DNA疫苗免疫保護(hù)作用的影響。
　　 方法：從本室保存的DH5α大腸桿菌體內(nèi)提取已構(gòu)建好的pEGFP-Sj26GST重組質(zhì)粒，進(jìn)行鑒定。50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，即感染對(duì)照組、CIM單用組、pEGFP-N3空載體對(duì)照組、pE

9、GFP-Sj26GST DNA疫苗組及CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用組。其中疫苗組每只小鼠在第1、14及28天時(shí)分別經(jīng)股四頭肌注射100 μg pEGFP-Sj26GST DNA疫苗或pEGFP-N3空載體，CIM組每只小鼠從首次免疫前兩天開(kāi)始每天皮下注射25mg/kg的CIM直至感染前。末次免疫后2周，各組小鼠均經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴40條/鼠。感染后第6周殺鼠沖蟲(chóng)，計(jì)數(shù)每只小鼠的蟲(chóng)荷及肝內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)。計(jì)算減蟲(chóng)率

10、和肝組織中每條雌蟲(chóng)的減卵率。取出小鼠肝組織用福爾馬林固定，脫水、石蠟切片、HE染色，檢測(cè)各組小鼠肝組織內(nèi)蟲(chóng)卵肉芽腫的變化。
　　 結(jié)果：將大量提取出的pEGFP-Sj26GST重組質(zhì)粒及pEGFP-N3空載體質(zhì)粒在核酸分析儀上檢測(cè)發(fā)現(xiàn)濃度達(dá)到3mg/ml且純度較高。動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗聯(lián)合使用后減蟲(chóng)率高達(dá)79％，顯著高于pEGFP-Sj26GST疫苗單獨(dú)使用組（27％）及其他各組

11、。肝臟內(nèi)蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)其肝減卵率與pEGFP-Sj26GST DNA疫苗單用組相比，聯(lián)合使用CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗也有顯著的降低（22.48％vs68.35％）。小鼠肝組織HE染色顯示，和感染對(duì)照組相比，CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用組的蟲(chóng)卵肉芽腫數(shù)目(16.25±2.87vs4.5±1.76)顯著減少。顯微鏡下可見(jiàn)，感染對(duì)照組的肝肉芽腫體積較大，而pEGFP-Sj26GST疫苗組及與CIM合用

12、組的肝肉芽腫體積則明顯縮小。
　　 結(jié)論：CIM可作為佐劑增強(qiáng)血吸蟲(chóng)pEGFP-Sj26GST DNA疫苗的免疫保護(hù)效果。且CIM和疫苗合用可以顯著減少血吸蟲(chóng)感染宿主肝內(nèi)蟲(chóng)卵肉芽腫的數(shù)目。
　　 第三部分：西咪替丁增強(qiáng)日本血吸蟲(chóng)pEGFP-Sj26GST DNA疫苗的免疫保護(hù)作用的機(jī)制研究。
　　 目的：觀察CIM對(duì)宿主體內(nèi)CD4+CD25+Tregs及相關(guān)細(xì)胞因子的影響，探討CIM增強(qiáng)pEGFP-Sj26GST

13、 DNA疫苗免疫保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 方法：80只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成五組，即感染對(duì)照組、CIM組、pEGFP-N3空載體對(duì)照組、pEGFP-Sj26GST DNA疫苗組及CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用組。其中疫苗組每只小鼠在第1、14及28天時(shí)分別經(jīng)股四頭肌注射100 μg pEGFP-Sj26GST DNA疫苗或pEGFP-N3空載體，即每只小鼠免疫三次，每次間隔2周。CIM組每只小鼠從首次免疫

14、前兩天開(kāi)始每天皮下注射25mg/kg的CIM直至感染前。各組取6只小鼠在末次免疫后一周剖殺，取眼眶血，靜置后離心取上清，檢測(cè)其血清中特異性GST抗體的含量。將剩余的50只小鼠在末次免疫后2周均經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴40條/鼠。感染后第6周，剖殺小鼠，無(wú)菌取脾，制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Tregs百分比。將無(wú)菌取出的脾細(xì)胞懸液在體外用絲裂原ConA刺激后培養(yǎng)48小時(shí)，MTT法檢測(cè)在體外各組脾細(xì)胞

15、對(duì)絲裂原的增值比率。體外培養(yǎng)72小時(shí)離心收集各組脾細(xì)胞上清，夾心ELISA法分別檢測(cè)脾細(xì)胞上清中Th1細(xì)胞因子γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）和Th2細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）等細(xì)胞因子含量。
　　 結(jié)果：⑴使用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗后小鼠血清中特異性的抗Sj26GST抗體的水平明顯高于空載體組及單用CIM組（p＜0.05），

16、且將pEGFP-Sj26GST DNA疫苗和CIM合用后小鼠血清中特異性的抗Sj26GST抗體的水平亦顯著高于單獨(dú)使用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗組。⑵和感染對(duì)照組相比，單用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗可以降低其脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例（p＜0.05），而將CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用則可以顯著降低其脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例。⑶和感染對(duì)

17、照組相比，單用CIM后脾淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的增殖反應(yīng)明顯提高，而合用CIM及pEGFP-Sj26GST DNA疫苗后，脾淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的增殖反應(yīng)則較單獨(dú)使用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗組亦有顯著提高。⑷CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12、IFN-γ的水平均較感染對(duì)照組高（P＜0.05），IL-10的含量較對(duì)照組降低（P＜0.05），而IL-4、IL-5的水平雖較對(duì)照組升高，但