白頭翁總皂苷對(duì)日本血吸蟲(chóng)及其宿主的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)研究白頭翁總皂苷（Pulsatilla chinensis(Bunge) Regel saponins，PRS）對(duì)日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum）中間宿主釘螺（Oncomelania hupensis）的殺滅作用、對(duì)釘螺新陳代謝關(guān)鍵酶的影響、對(duì)斑馬魚(yú)和哺乳動(dòng)物的毒性、對(duì)日本血吸蟲(chóng)體內(nèi)外不同發(fā)育階段的作用及對(duì)感染日本血吸蟲(chóng)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，為白頭翁總皂苷成為新的抗血吸蟲(chóng)新藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)

2、。
　　方法：
　　1.采用浸泡法，進(jìn)行浸殺釘螺試驗(yàn)、釘螺上爬試驗(yàn)及斑馬魚(yú)毒性試驗(yàn)；采用酶促動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)釘螺暴露在PRS濃度為浸泡24h LC50的40%和80%藥液中24h后的頭足及肝臟膽堿酯酶（choline esterase，CHE）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydro

3、genase，LDH）的酶活值；采用透射電鏡觀察濃度為24h LC50的PRS作用釘螺后其頭足及肝臟的超微結(jié)構(gòu)；采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB15670-1995進(jìn)行哺乳動(dòng)物急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)和皮膚、眼睛刺激試驗(yàn)。
　　2.采用尾蚴腹部貼片法感染ICR小鼠，感染后42d的小鼠肝臟經(jīng)過(guò)研磨、過(guò)篩獲得蟲(chóng)卵，毛蚴由蟲(chóng)卵孵化，尾蚴由陽(yáng)性感染釘螺光照逸出，用含有0、1、2、3、4、5、6、7、8μg/ml的PRS藥液分別在不同的時(shí)間作用于蟲(chóng)卵

4、、毛蚴、尾蚴；PRS對(duì)體外培養(yǎng)的日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段的作用采用經(jīng)皮膚或灌注沖蟲(chóng)法在3h、7、14、42d對(duì)感染不同數(shù)量尾蚴的小鼠進(jìn)行剖殺取蟲(chóng)，用含有0、1、5、10、20、30μg/ml的PRS培養(yǎng)液對(duì)童蟲(chóng)及成蟲(chóng)進(jìn)行培養(yǎng)，觀察藥物在不同時(shí)間段的殺蟲(chóng)作用；將感染50條日本血吸蟲(chóng)尾蚴的小鼠在血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段用不同劑量的PRS藥液灌服，42d后灌注沖蟲(chóng)計(jì)算荷蟲(chóng)量及減蟲(chóng)率；將感染80條尾蚴的小鼠在感染后的不同時(shí)間經(jīng)過(guò)尾靜脈注射25mg/kg

5、 PRS藥液，42d后灌注沖蟲(chóng)計(jì)算荷蟲(chóng)量及減蟲(chóng)率；PRS對(duì)日本血吸蟲(chóng)糖原、蛋白及酶的影響采用對(duì)感染42d的小鼠一次性尾靜脈注射25mg/kg的PRS藥液，24h后剖殺取蟲(chóng)研磨，檢測(cè)PRS對(duì)蟲(chóng)新陳代謝的影響。
　　3.采用感染50條尾蚴的C57BL/6小鼠連續(xù)49d口服150mg/kg/d劑量的PRS，通過(guò)檢測(cè)小鼠體重、肝脾重量的變化及減蟲(chóng)效果估計(jì)長(zhǎng)期用藥的治療效果；通過(guò)檢測(cè)感染治療組與感染不治療組之間小鼠白細(xì)胞及其組成細(xì)胞的比率變

6、化、肝臟的免疫組化、血清IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-17水平的變化、蟲(chóng)卵可溶性抗原（soluble egg antigen，SEA）特異性抗體IgG、IgG1、IgG2a值的改變探究PRS對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：
　　1. PRS經(jīng)過(guò)24h、48h、72h浸殺釘螺后的LC50分別為0.48、0.23、0.17mg/l， LC90分別為2.64、0.81、0.34mg/l；8和4mg/l P

7、RS作用后無(wú)釘螺上爬，0.5mg/l PRS作用24h后總上爬率為26.67%，0.5mg/lNIC作用24h后總上爬率為47.78%。釘螺用PRS濃度為40%及80%的24h LC50浸泡24h后，其頭足及肝臟的CHE、AKP、ALT的活力明顯降低（P＜0.05），LDH變化不大；24h LC50 PRS作用24h后，釘螺頭足及肝臟細(xì)胞的透射電鏡顯示PRS對(duì)釘螺的超微結(jié)構(gòu)有一定程度的損傷；斑馬魚(yú)試驗(yàn)顯示相對(duì)于氯硝硫胺（niclosam

8、ide，NIC），PRS對(duì)魚(yú)類(lèi)的致死濃度與殺螺濃度差別較大；哺乳動(dòng)物急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、眼刺激實(shí)驗(yàn)、急性皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果顯示PRS對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)毒性。
　　2.不同濃度的PRS及對(duì)照藥物吡喹酮（praziquantel，PZQ）對(duì)日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵作用24h后的孵化結(jié)果顯示PRS對(duì)蟲(chóng)卵孵化的抑制效果略?xún)?yōu)于PZQ的作用，尤其是在4μg/ml濃度時(shí)，日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵對(duì) PRS的作用更敏感；PRS及對(duì)照藥物PZQ在不同時(shí)間對(duì)毛蚴、尾蚴的作用結(jié)果顯

9、示其死亡率對(duì)PRS及PZQ的濃度及作用時(shí)間有一定的依賴(lài)性；在不同濃度PRS作用下日本血吸蟲(chóng)各個(gè)發(fā)育時(shí)期體外培養(yǎng)的結(jié)果顯示藥物對(duì)日本血吸蟲(chóng)的3h、7、14d童蟲(chóng)及42d成蟲(chóng)均有殺傷作用；日本血吸蟲(chóng)雄蟲(chóng)及雌蟲(chóng)經(jīng)過(guò)30μg/ml PRS體外作用4h后蟲(chóng)體體表的感覺(jué)乳突及皮層均有一定程度的損壞；不同劑量PRS對(duì)不同感染時(shí)期的小鼠口服用藥結(jié)果表明高、中、低劑量的PRS在體內(nèi)均有一定的殺蟲(chóng)作用，但300mg/kg劑量的PRS有較好的療效，感染1d和

10、21d開(kāi)始用藥的殺蟲(chóng)及殺雌蟲(chóng)效果均優(yōu)于相同劑量的青蒿琥酯（artesunate，ART）和PZQ；尾靜脈注射25mg/kg劑量PRS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在日本血吸蟲(chóng)感染小鼠的不同階段用藥均有比較好的殺蟲(chóng)作用；25mg/kg劑量 PRS作用24h后日本血吸蟲(chóng)雄蟲(chóng)、雌蟲(chóng)的糖原、蛋白、AKP、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽還原酶（glutathio

11、ne reductase，GR）均有所降低。
　　3.用150mg/kg/d劑量的PRS連續(xù)49d灌服感染50條尾蚴的C57BL/6小鼠發(fā)現(xiàn)，PRS治療組小鼠體重的增加與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01），肝脾重量的降低與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01）；PRS治療后小鼠白細(xì)胞的降低與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01），中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞比率的降低與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0

12、.01），淋巴細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞比率的增多與感染不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01）；PRS長(zhǎng)期用藥對(duì)感染50條尾蚴小鼠的荷蟲(chóng)量結(jié)果顯示PRS用藥組與感染不治療組比較減蟲(chóng)效果存在明顯差異（P＜0.01），減蟲(chóng)率為55.27%。肝臟蟲(chóng)卵的減少與不治療組比較存在明顯差異（P＜0.01）；用藥49d后小鼠肝臟的蘇木素伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）顯示PRS用藥組肝臟的蟲(chóng)卵及卵周?chē)仔约?xì)胞相

13、對(duì)于感染不治療組較少；免疫組化顯示 PRS藥物治療后肝臟的α-平滑肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、金屬蛋白酶抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor beta1， TGF-β1）、Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ）及Ⅳ型膠原（collagen typ

14、eⅣ）的表達(dá)與感染不治療組比較明顯減弱；PRS治療組與感染不治療組比較小鼠血清中的IFN-γ、IL-4、TGF-β和 IL-17水平均有明顯差異（P＜0.01）；PRS治療組SEA特異性抗體IgG、IgG1水平與感染不治療組相比明顯降低（P＜0.01）；PRS治療組與感染不治療組相比SEA特異性抗體IgG2a水平變化不大（P＞0.05），PRS治療組與感染不治療組相比較IgG1/IgG2a比率降低。
　　結(jié)論：
　　1.實(shí)驗(yàn)