GPR30在家族性肌萎縮側(cè)索硬化動物模型腰段脊髓中的表達(dá)特征.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)選擇性累及大腦皮層、腦干和脊髓前角的運動神經(jīng)元，病發(fā)后肌肉進(jìn)行性萎縮、無力，多于發(fā)病后2到5年內(nèi)死于呼吸衰竭，是一種漸進(jìn)性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。約90％～95％的ALS為散發(fā)性，稱為散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化(SpradicamyotrophiclateralsclerosisSALS)，目前發(fā)病機制不清，多認(rèn)為與氧化損傷、氨基酸興奮性性毒性、凋亡、線粒體損傷、

2、軸漿轉(zhuǎn)運異常、細(xì)胞骨架異常等有關(guān)，但是，每一種假說都不能完全詮釋其發(fā)病過程;另5％～10％的ALS為家族性(FimilyamyotrophiclateralsclerosisFALS)，認(rèn)為其中20％的發(fā)病與SOD1基因突變有關(guān)，而且SOD1G93A基因突變模型是目前應(yīng)用最廣的ALS研究在體動物模型。
　　多年來的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ALS發(fā)病存在明顯的性別差異:男性發(fā)病率大于女性，并且該差異隨年齡增長而減小[1]，女性比男性發(fā)病年齡

3、相對較晚[2]。這提示ALS發(fā)病的性別差異或許源于雌激素(Estrogen，E)對神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　雌激素(Estrogen，E)為甾體類固醇性激素，文獻(xiàn)報道E的靶器官包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)[3-6]。并且有研究證明E是一種神經(jīng)保護(hù)因子[7-9]，在許多神經(jīng)變性疾病模型中具有促進(jìn)神經(jīng)元生存，保護(hù)組織完整性的作用[10-12]。越來越多的證據(jù)支持E在大腦的調(diào)節(jié)作用及其在年齡增長過程中維持大腦功能的重要性。年齡相關(guān)的E水平下降對大腦功

4、能有不良影響，激素的減少與神經(jīng)變性疾病的進(jìn)展有關(guān)。
　　雌激素的生物學(xué)功能大部分由經(jīng)典的雌激素核受體ERα/β通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來介導(dǎo)[13-14]，通常要數(shù)小時到數(shù)天起效，是經(jīng)典的慢速基因通路。研究發(fā)現(xiàn)ERα/β主要分布在脊髓后角外層[15-18]，而在前角運動神經(jīng)元幾乎沒有ERα/β的表達(dá)。大量研究發(fā)現(xiàn)，E2可以在數(shù)分鐘甚至數(shù)秒內(nèi)發(fā)揮改善血供、抗化、抗興奮性毒性的作用，且為非ERα/β位點依賴型。這提示除了經(jīng)典的慢速基因通路，E

5、2還可以經(jīng)非基因快速通路起效。繼而有文獻(xiàn)報道E可以通過膜受體G-proteincoupledreceptor30(GPR30)發(fā)揮其快速非基因作用[19]。兩個獨立的研究機構(gòu)分別發(fā)現(xiàn)GPR30（又稱GPER1）是一種新型雌激素受體[20-22]，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布[23-27]。近來的兩項實驗研究報道GPR30在脊髓自主神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)節(jié)有表達(dá)[28-29]。更有研究發(fā)現(xiàn)GPR30在脊髓前角運動神經(jīng)元有表達(dá)，這項研究認(rèn)為GPR30有

6、可能介導(dǎo)了E2對于運動神經(jīng)元的保護(hù)作用，并且發(fā)現(xiàn)雌激素不僅能通過激活GPR30發(fā)揮對運動神經(jīng)元的保護(hù)作用，還可能通過上調(diào)GPR30的表達(dá)而增強其作用[30]。
　　SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠（ALS小鼠）是FALS動物模型，其特征性臨床表現(xiàn)為成年（12周左右）發(fā)病，后肢運動功能障礙并逐漸進(jìn)展至終末期（17-20周）[31]。而有關(guān)GPR30在ALS小鼠脊髓表達(dá)情況的報道少見。
　　本實驗應(yīng)用SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察G

7、PR30在ALS小鼠癥狀前期，癥狀早期和終末期腰段脊髓的表達(dá)特征，旨在探討性激素(sexhormon)與ALS發(fā)病中的關(guān)系，為進(jìn)一步研究奠定理論依據(jù)。實驗內(nèi)容分為三部分:
　　第一部分GPR30在不同時期ALS小鼠腰段脊髓前角運動神經(jīng)元的表達(dá)
　　方法:
　　1、模型建立及分組
　　飼養(yǎng)繁殖SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠，參照韋爾切利1-5分評分法，發(fā)病時為4分，死亡時為1分，60天為癥狀前期，4分為癥狀早期，1

8、分為終末期[32]。各對照組為同窩、同月齡不攜帶突變SOD1基因的小鼠。每組各3只小鼠。
　　2、取材
　　應(yīng)用10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，4％多聚甲醛心臟灌注固定20min，取小鼠脊髓腰膨大，分別以4％多聚甲醛固定48h。
　　3、免疫組化染色
　　后固定的組織塊震蕩切片25μm厚，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法觀察GPR30在ALS小鼠各時期腰段脊髓的表達(dá)分布特征。計數(shù)脊髓兩側(cè)前角GPR30免疫陽性

9、α運動神經(jīng)元數(shù)量，并觀察脊髓前角有無GPR30免疫陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。脊髓前角α運動神經(jīng)元數(shù)量的計數(shù)方法:對連續(xù)切片的每第五張切片的雙側(cè)脊髓前角的α運動神經(jīng)元計數(shù)，每段腰髓觀察10個切片。被計數(shù)的α運動神經(jīng)元標(biāo)準(zhǔn)為:位于前角、直徑＞25μm，細(xì)胞核清楚[33]。星形膠質(zhì)細(xì)胞的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)為:位于前角，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核清楚，細(xì)胞突起粗短，分支多[34]。
　　4、統(tǒng)計學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處

10、理。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示腰段脊髓切片兩側(cè)脊髓前角α運動神經(jīng)元計數(shù)之和，三組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩個獨立樣本比較的t檢驗，以α=0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1、SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
　　子代鼠的基因組DNA經(jīng)過PCR擴增之后、在GBOX-HR全自動凝膠成像系統(tǒng)下其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示(Fig.1):SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽性小鼠PCR產(chǎn)物條帶位于200-300bp之

11、間(236bp)。沒有此條帶為非mSOD1的PCR產(chǎn)物，為非SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠，即陰性對照小鼠。
　　2、GPR30免疫組化
　　2.1ALS小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期腰段脊髓前角GPR30免疫陽性α運動神經(jīng)元計數(shù)分別為17.87±4.10、11.93±2.94、2.87±0.83，隨著ALS病情進(jìn)展，免疫陽性α運動神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少，到終末期僅見極少數(shù)殘存α運動神經(jīng)元，且各時期間均有顯著性差異(P＜0.05);對

12、照組各時期α運動神經(jīng)元計數(shù)分別為22.93±4.62、23.13±3.99、19.8±3.41，各時期間無顯著性差異（P＞0.05）;各時期ALS小鼠GPR30免疫陽性α運動神經(jīng)元數(shù)目與對照組相比均減少，且有顯著性差異(Table1，Graph1)(Fig.2200×)。
　　2.2從分布部位看:對照組GPR30的表達(dá)在脊髓前角神經(jīng)元胞漿內(nèi)較均勻表達(dá)，核周圍著色較深;而轉(zhuǎn)基因鼠脊髓前角神經(jīng)元GPR30著色不均，呈顆粒狀深染，形成包

13、涵體樣的結(jié)構(gòu);而且，與對照組不同，可見著色的星形膠質(zhì)細(xì)胞(Fig.2200×，F(xiàn)ig.3400×)。
　　結(jié)論:
　　GPR30在脊髓前角神經(jīng)元有表達(dá)，主要在胞漿內(nèi)表達(dá);隨病情進(jìn)展，ALS轉(zhuǎn)基因鼠GPR30免疫陽性運動神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，著色不均，呈顆粒狀深染，形成類包涵體樣結(jié)構(gòu)，并且出現(xiàn)GPR30陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　第二部分GPR30在ALS小鼠脊髓前角細(xì)胞分布特征
　　方法:
　　1、取60天齡S

14、OD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠及其對照組各3只。
　　2、取材
　　10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心臟灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰膨大，分別以4％多聚甲醛固定48h。
　　3、免疫熒光染色
　　后固定的組織塊震蕩切片30μm厚，應(yīng)用免疫熒光三標(biāo)染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察GPR30在ALS小鼠腰段脊髓前角細(xì)胞的分布特征。
　　結(jié)果:
　　通過特異性免疫熒光三標(biāo)的方法

15、，我們發(fā)現(xiàn)GPR30在ALS小鼠脊髓前角α運動神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均有特異性表達(dá)。在對照組，GPR30主要在α運動神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞也存在GPR30陽性表達(dá)，但數(shù)目極少(Fig.4，5)。
　　結(jié)論:
　　GPR30在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠呈現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常表達(dá)。
　　第三部分GPR30在不同時期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。
　　方法:
　　1、取第一部分

16、所固定各組小鼠的脊髓腰膨大。
　　2、免疫熒光染色
　　后固定的組織塊震蕩切片30μm厚，應(yīng)用免疫熒光三標(biāo)染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察GPR30在ALS小鼠腰段脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　隨病情進(jìn)展，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠GPR30免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，熒光強度明顯增強。而對照組各時期GPR30免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞都很少，熒光強度無明顯增強(Fig.6-11)。
　　結(jié)論: