家族性肌萎縮側(cè)索硬化動物模型腰段脊髓泛素表達(dá)特征.pdf

1、目的：肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis， ALS）是一種進(jìn)行性加重的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，選擇性損害脊髓前角的運動神經(jīng)元、腦干運動神經(jīng)核運動神經(jīng)元及大腦運動皮層的大錐體細(xì)胞，表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌肉無力、肌肉萎縮、肌束震顫、腱反射亢進(jìn)，病理征陽性，最終呼吸衰竭死亡。90％～95％的ALS為散發(fā)性，5％～10％的ALS為家族性，約20％的家族性ALS與Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變有關(guān)。目

2、前該病發(fā)病機制尚不清楚，但殘存運動神經(jīng)元中存在泛素陽性包涵體是ALS的重要病理特征之一。
　　 泛素是真核細(xì)胞中普遍存在且序列高度保守的小分子球形蛋白質(zhì)，其分子量約8.5K Da，由76個氨基酸殘基組成，能夠共價結(jié)合細(xì)胞中的受體蛋白。泛素與泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3、去泛素化酶、蛋白酶體及其底物（蛋白質(zhì)）構(gòu)成泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system， UPS)。UPS是細(xì)胞內(nèi)

3、蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細(xì)胞內(nèi)80％以上蛋白質(zhì)的降解。大量研究認(rèn)為UPS在錯誤折疊蛋白或其他突變蛋白的降解過程中也發(fā)揮重要作用。泛素蛋白酶體降解通路失調(diào)可導(dǎo)致異常蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚，并進(jìn)一步引起細(xì)胞功能紊亂及變性。UPS功能異?？梢园l(fā)生于UPS途徑的任何一個環(huán)節(jié)，如泛素化過程中泛素量的失衡，泛素結(jié)合過程中泛素活化酶E1，泛素結(jié)合酶E2，泛素連接酶E3功能失調(diào)，蛋白酶體降解水平失調(diào)或去泛素化水平失調(diào)等。實驗表明，在ALS包涵體中所見的泛素

4、連接酶Dorfin能特異性結(jié)合并泛素化各種突變的SOD1，對野生型SOD1無影響。過量的Dorfin可減少SOD1包涵體的形成，從而保護(hù)神經(jīng)元免受SOD1毒性的損害。因此，泛素蛋白酶體降解系統(tǒng)和ALS的發(fā)病可能存在密切關(guān)系。
　　 本實驗應(yīng)用家族性肌萎縮側(cè)索硬化動物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠）觀察泛素在ALS病程不同階段的表達(dá)情況，旨在探討泛素蛋白在ALS的發(fā)病中的作用。
　　 方法：飼養(yǎng)繁殖家族性肌萎縮側(cè)索硬化動

5、物模型SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠，參考Weydt，P．的描述將SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠分為癥狀前期（60天），癥狀早期，終末期。對照組動物為實驗組小鼠同窩非轉(zhuǎn)人突變SOD1基因小鼠。
　　 1 10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心臟灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)組織切片（5μm厚）。5μm厚的石蠟切片應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP的方法顯示泛素

6、在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠不同時期脊髓前角細(xì)胞的表達(dá)分布形式。
　　 2 10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，新鮮取小鼠脊髓腰段，液氮速凍，-80℃儲藏，提取總蛋白用蛋白免疫印跡的方法檢測泛素在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠不同時期腰段脊髓的表達(dá)量的情況。
　　 3 10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，新鮮取小鼠脊髓腰段，液氮速凍，-80℃儲藏，提取RNA反轉(zhuǎn)錄后，擴增目的基因用PCR的方法檢測泛素基因

7、在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠不同時期脊髓前角的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。
　　 4 計量資料用x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠不同時期組與對照組泛素轉(zhuǎn)錄mRNA水平及蛋白表達(dá)水平的總體比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1 泛素免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組小鼠不同年齡階段腰段脊髓前角神經(jīng)元均有泛素表達(dá)，無明顯差別。SOD1G

8、93A轉(zhuǎn)基因小鼠隨病情進(jìn)展，泛素陽性蛋白表達(dá)逐漸聚集，形成泛素陽性聚集體。
　　 2 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的腰髓總蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，隨著病情進(jìn)展8.5K Da的單泛素及分子量17K Da以上的多聚泛素蛋白水平表達(dá)無明顯增加(F=0.241，1.972，P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的腰髓mRNA反轉(zhuǎn)錄后，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠不同時期組與對照組相比，泛素mRNA-UBA

9、有差異(F=9.938，P＜0.05)。癥狀早期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠與對照組小鼠相比UBA無明顯差異，P=0.08＞0.05。癥狀早期與癥狀前期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠相比UBA表達(dá)明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.04＜0.05。終末期與癥狀前期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠相比UBA表達(dá)明顯增加，有統(tǒng)計學(xué)意義，P=0.01＜0.05。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠病情進(jìn)展過程中，各時期相比及各時期與對照組相比UBB均無明顯差異（F=0