家族性肌萎縮側(cè)索硬化模型SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠認智功能研究.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis ALS)是一種神經(jīng)系統(tǒng)的變性疾病,一般認為ALS選擇性損傷大腦皮層大錐體細胞及腦干運動神經(jīng)核、脊髓前角的運動神經(jīng)元,造成了腦和脊髓運動神經(jīng)元的丟失,具體機制不明。然而在臨床工作中發(fā)現(xiàn)ALS患者除運動系統(tǒng)癥狀外,部分伴有認知功能損害、感覺障礙、眼球運動障礙、自主神經(jīng)功能障礙等運動系統(tǒng)外癥狀。因此,探討ALS是否呈多系統(tǒng)累及,是我們需要關(guān)注的問題之一。

2、　　 ALS伴發(fā)的運動系統(tǒng)損害外癥狀中,以認知功能損害最為常見,而海馬是公認的與認知功能有關(guān)的結(jié)構(gòu)。在ALS患者的尸檢研究中發(fā)現(xiàn)患者海馬區(qū)可發(fā)現(xiàn)泛素陽性胞質(zhì)內(nèi)圓形、橢圓形包涵體,支持ALS累及非運動系統(tǒng),并可能與臨床上常見的認知功能損害有關(guān)。
　　 泛素系統(tǒng)(UPS)主要由泛素活化酶、泛素結(jié)合酶、泛素蛋白連接酶和26S蛋白酶體組成。其廣泛存在于真核生物中,降解80％以上的細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白或其他突變蛋白,是精細的特異性的蛋白質(zhì)

3、降解系統(tǒng),是體內(nèi)重要的細胞調(diào)控體系。研究認為泛素蛋白酶體降解通路失調(diào)可導(dǎo)致異常蛋白在細胞內(nèi)積聚,并進一步引起細胞功能紊亂及變性。因此,泛素蛋白在海馬區(qū)的表達異?？蓪?dǎo)致底物蛋白在細胞中異常聚集,形成胞質(zhì)內(nèi)包涵體,損害海馬神經(jīng)元細胞的正常功能,導(dǎo)致認知功能的損害。
　　 本實驗應(yīng)用家族型肌萎縮側(cè)索硬化動物模型-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠,通過對動物的行為學(xué)改變及海馬區(qū)病理學(xué)變化的研究,探討ALS是否存在認知功能的損害及認知功能的損害

4、與泛素海馬區(qū)異常表達的相關(guān)性,為臨床研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.實驗動物模型的建立由B6SJL2 BTg(SOD12G93A)1Gur/J半合子雄鼠及B6SJLF1/J+/+雌鼠(購自美國Jackson Lab)配種,在恒溫(22～27℃)、恒濕(40～50％)、無特殊病原菌的動物房中繁殖、飼養(yǎng)SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠,喂以滅菌水及顆粒型鼠類飼料。剪取小鼠尾部組織1mm,提取DNA,PCR技擴增,PCR產(chǎn)

5、物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，在長波紫外光下觀察條帶結(jié)果,鑒定SOD1(+)小鼠及SOD1(-)同窩對照小鼠。
　　 2.動物分組
　　 Y型迷宮預(yù)選對電擊反應(yīng)較敏感,逃避反應(yīng)迅速的60只小鼠(SOD1G93A轉(zhuǎn)基因清潔小鼠30只、同窩陰性對照小鼠30只)供實驗用。隨機分為60天組、90天組及120天組(onset3.5分),每組各20只。
　　 3.SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠評分標準應(yīng)用Vercelli et

6、al的行為學(xué)評分系統(tǒng)于SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠100天每周對動物的全身狀態(tài)進行評分,1～5分定義如下:5:健康,不伴任何癱瘓癥狀4:輕微步態(tài)不穩(wěn)及后肢癱瘓癥狀3:明顯癱瘓及步態(tài)不穩(wěn)2:后肢完全性癱瘓,動物僅靠前肢爬行1:后肢完全性癱瘓,動物主要呈側(cè)臥位,和/或翻轉(zhuǎn)后不能翻身或體重下降超過初始體重的20％。
　　 4.跳臺試驗
　　 試驗分兩天進行:第一天,訓(xùn)練前先將不同病程的SOD1G93A轉(zhuǎn)基因清潔小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)自

7、由活動3min,熟悉環(huán)境。然后將動物置于銅柵上,接通銅柵電源,通以36V交流電。動物受到電擊,觀察記錄動物5 min內(nèi)第一次找到平臺的時間(為學(xué)習反應(yīng)時間)及5 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)(為學(xué)習錯誤次數(shù)),學(xué)習反應(yīng)時間及學(xué)習錯誤次數(shù)用以評價小鼠的學(xué)習功能。第二天,學(xué)習訓(xùn)練24h后,將動物置于平臺上,接通銅柵電源,通以36V交流電。記錄受測的動物5 min內(nèi)第一次跳下平臺的時間(為記憶潛伏時間),和5 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)(為記憶錯誤次數(shù)

8、),記憶潛伏時間及記憶錯誤次數(shù)用以評價小鼠的記憶功能。
　　 實驗過程中,動物有前肢躍起指向性找到平臺的動作記錄入學(xué)習反應(yīng)時間,前肢指向性觸及銅柵記錄入記憶潛伏時間及學(xué)習、記憶錯誤次數(shù)。
　　 5.組織病理學(xué)在動物麻醉狀態(tài)下,4％多聚甲醛左心室快速灌注,留取腦組織。4％多聚甲醛固定24h后,于視神經(jīng)水平腦橫斷面暴露海馬,梯度酒精脫水,石蠟包埋,組織切片,免疫組織化學(xué)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察海馬區(qū)泛素的表達情況。
　　

9、 結(jié)果:SODlG93A轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶潛伏時間較同窩陰性對照小鼠延長,60天、90天及120天SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶潛伏時間分別為68.00±47.16s,55.20±92.99s,110.10±116.52s,同窩陰性對照小鼠的記憶潛伏時間分別為65.60±89.94s,158.00±88.31s,169.80±122.96s;同時SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠5min內(nèi)記憶錯誤次數(shù)較同窩陰性對照小鼠增多,60天、90天及1

10、20天SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的5min內(nèi)記憶錯誤次數(shù)分別為3.40±2.84次,5.20±3.08次,1.80±1.32次,同窩陰性對照小鼠的記憶錯誤次數(shù)分別為3-30±2.16次,2.30±1.95次,2.00±2.75次。經(jīng)t檢驗,各組SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶潛伏時間及記憶錯誤次數(shù)均較同窩陰性對照小鼠存在顯著性改變(P＜0.05),而學(xué)習反應(yīng)時間及5min內(nèi)學(xué)習錯誤次數(shù)較同窩陰性對照小鼠無明顯差異性變化(P＞0.05)。

11、而隨SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠病程的延長,其記憶潛伏時間之間并無顯著性差異(P＞0.05),而5min內(nèi)記憶錯誤次數(shù)隨病程延長存在統(tǒng)計學(xué)意義上的增多(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)染色顯示在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠海馬的CA1、CA3及齒狀回區(qū)均可發(fā)現(xiàn)泛素蛋白在細胞核周體的新月狀或環(huán)形包涵體或粗顆粒狀沉積,而在其同窩陰性對照的小鼠海馬的CA1、CA3及齒狀回區(qū)亦存在泛素的廣泛表達,但表現(xiàn)為細顆粒狀細胞質(zhì)內(nèi)的彌漫性廣泛表達。并且SOD1G

12、93A轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1、CA3及齒狀回區(qū)的泛素陽性反應(yīng)細胞比率均較同窩陰性對照小鼠顯著性增多(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶功能在發(fā)病早期較同窩陰性對照小鼠已出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的減退,且5min內(nèi)記憶錯誤次數(shù)隨病程延長而增多,而學(xué)習功能受損不明顯。但SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠所表現(xiàn)出的記憶潛伏時間的縮短,與病程長短之間并無明顯的相關(guān)性。同時,在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的病理免疫組織化學(xué)染色可見