2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)是一種運動神經(jīng)元病,主要病理特點為選擇性侵犯脊髓前角細胞、腦干運動神經(jīng)元、皮質(zhì)錐體細胞及錐體束。它是一種進展性、致命性的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,病人逐漸出現(xiàn)四肢無力,最后累及呼吸肌,多于發(fā)病3-5年內(nèi)死亡。盡管經(jīng)過了大量的努力,ALS的發(fā)病機制目前仍舊是未完全了解的,疾病潛在機制的闡明對制定有效的治療措施是至關(guān)重要的。最近的研究證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endopla

2、smicreticulumstress,ERS)參與家族性ALS(familialALS;FALS)以及散發(fā)性ALS(sporadicALS;SALS)的發(fā)病機制。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中出現(xiàn)錯誤折疊蛋白的聚集或者鈣離子循環(huán)紊亂時就會發(fā)生ERS。為了應對這種應激,細胞發(fā)生保護性反應,即未折疊蛋白反應(unfoldedproteinresponse;UPR)。UPR主要包括三個感受蛋白:轉(zhuǎn)錄激活因子6(activatingtranscriptionf

3、actor6;ATF6)、肌醇需求激酶1(inositolrequiringkinase1;IRE1)、雙鏈RNA激活蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(double-strandedRNA-activatedproteinkinase-likeendoplasmicreticulumkinase;PERK)。在正常生理情況下,ATF6、IRE1、PERK與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulatedprotein78;GRP78)

4、又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(bindingimmunoglobulinheavychainprotein;BIP)結(jié)合,處于無活性狀態(tài)。當ERS發(fā)生時,三個感受蛋白與GRP78解離,激活下游的信號通路幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復穩(wěn)態(tài)。如若穩(wěn)態(tài)不能恢復,應激持續(xù)存在時,細胞就會發(fā)生凋亡。
   X盒結(jié)合蛋白1(X-boxbindingprotein1;XBP-1)是ERS中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子,ERS發(fā)生時,IRE1剪接XBP-1mRNA,剪接

5、的XBP-1mRNA進入細胞核,上調(diào)分子伴侶等基因的表達來幫助恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn),ERS保護劑Salubrinal,能夠減輕ALS小鼠模型的臨床表現(xiàn),并能延緩疾病的進展。對ALS中ERS的研究為ALS發(fā)病機制的研究展開了新的一頁。并有望為ALS的治療提供新的觀點。
   臨床中大部分ALS是散發(fā)的,大約5-10%是家族性的。盡管SALS占大部分,但兩者有著極其相似的臨床表現(xiàn),對FALS的研究于SALS發(fā)病機制的闡明也有很大

6、幫助。FALS中約有20%是由突變的SOD1導致的。hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠是目前公認的FALS研究動物模型。本實驗研究ERS標記物XBP-1在不同時期hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓中的表達變化。
   方法:
   1hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖和鑒定
   將B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J半合子雄鼠和B6SJLF1雌鼠配種,剪取子代小鼠尾尖,提取組織DNA進行PCR鑒定。鑒定結(jié)

7、果中含有hSOD1基因的小鼠為hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠,hSOD1基因陰性的小鼠為非轉(zhuǎn)基因小鼠。
   2實驗分組:將hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠分為六組,每組3只,分別為出生后4周(28天)、5周(35天)、7周(49天)、9周(63天)、癥狀早期(約90天)、終末期(約120天)。其中前四組均為癥狀前期組。每組均設同性別、同年齡、同窩陰性對照。
   3觀察不同時期hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓中XBP-1的表

8、達變化
   3.1Western-blot:將到時期小鼠麻醉、摘眼球放血,留取新鮮腰髓標本,并-80℃保存。提取固定總蛋白并測定蛋白濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉后加一抗4℃過夜。次日,TPBS洗膜后加二抗室溫一小時,再次PBS清洗后掃膜儀掃膜,檢測各組標本中XBP-1的表達情況。
   3.2免疫組織化學:將到時期小鼠麻醉,4%多聚甲醛固定,留取固定后腰髓并4%多聚甲醛浸泡。將固定好腰髓用振蕩切片機

9、切成25μm厚標本。PBS清洗切片后10%H2O2浸泡,再用0.3%TritonX-100打孔。用10%馬血清室溫封閉30分鐘后加一抗4℃過夜。次日,PBS清洗后加二抗室溫孵育2小時。然后加辣根酶標記鏈霉卵白素室溫孵育1小時。最后進行常規(guī)DAB顯色、脫水、中性樹膠封片。在普通光學顯微鏡下觀察XBP-1在腰髓前角運動神經(jīng)元中的表達情況。
   3.3免疫熒光化學染色:將到時期小鼠麻醉,4%多聚甲醛固定,留取固定后腰髓并4%多聚甲醛

10、浸泡。將固定好腰髓用振蕩切片機切成25μm厚標本。用PBS清洗切片后浸泡在0.3%TritonX-100中室溫打孔30分鐘。用10%馬血清室溫封閉30分鐘后加一抗4℃過夜。次日,PBS清洗后加二抗以及細胞核染料Hoechst室溫孵育2小時。最后用抗熒光衰減淬滅劑封片。在共聚焦顯微鏡下觀察XBP-1在腰髓前角運動神經(jīng)元中的表達情況。4統(tǒng)計分析:將數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗以及方差齊性檢驗,服從正態(tài)分布以及方差齊性者以均數(shù)±標準差((X)±S)表示,

11、采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行檢驗。統(tǒng)計結(jié)果以P<0.05為具有顯著性差異。
   結(jié)果:
   1經(jīng)PCR鑒定將小鼠分為hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠。
   2Western-blot、免疫組織化學、免疫熒光化學結(jié)果顯示XBP-1在hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠中表達有差異。
   Western-blot結(jié)果顯示:癥狀早期和終末期轉(zhuǎn)基因小鼠組剪接的XBP-1均較非轉(zhuǎn)基因小鼠

12、組明顯增多;各時期轉(zhuǎn)基因小鼠組比較,剪接的XBP-1在癥狀早期和終末期增多,癥狀早期增多最顯著;癥狀前期(28d、35d、49d、63d)轉(zhuǎn)基因小鼠組和非轉(zhuǎn)基因小鼠組比較無明顯差距;各時期非轉(zhuǎn)基因小鼠組比較無明顯差距。癥狀早期和終末期轉(zhuǎn)基因小鼠組未剪接的XBP-1均較非轉(zhuǎn)基因小鼠組減少;癥狀前期(28d、35d、49d、63d)轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因組比較無明顯差距;各時期非轉(zhuǎn)基因小鼠組比較無明顯差距。
   免疫組織化學和免疫熒光

13、化學結(jié)果顯示:癥狀早期和終末期轉(zhuǎn)基因小鼠組腰髓前角運動神經(jīng)元與非轉(zhuǎn)基因小鼠組相比呈現(xiàn)明顯的核著色;癥狀前期(28d、35d、49d、63d)轉(zhuǎn)基因小鼠組與非轉(zhuǎn)基因小鼠組腰髓前角運動神經(jīng)元均未見明顯核著色;終末期轉(zhuǎn)基因小鼠組腰髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,胞體明顯皺縮。
   結(jié)論:XBP-1的剪接主要發(fā)生在hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病早期和終末期;在癥狀前期hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠中,未發(fā)現(xiàn)XBP-1發(fā)生明顯改變;終末期

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