鹽酸二甲雙胍對高糖環(huán)境下顱骨成骨細胞功能影響的機制研究.pdf

1、第一部分二甲雙胍對高糖環(huán)境大鼠顱骨成骨細胞增殖、分化和礦化的影響 目的：探討二甲雙胍對高糖培養(yǎng)的大鼠顱骨成骨細胞增殖、分化和礦化功能的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細胞，分別給予不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基：生理濃度葡萄糖(5.5 mmol/L)以及高濃度葡萄糖(11、22、44 mmol/L)，在此基礎上用不同濃度的二甲雙胍(0、10、40、160、320、640μmol/L)干預體外培養(yǎng)的原代大鼠顱骨成骨細胞，MTT法

2、檢測大鼠顱骨成骨細胞的增殖、磷酸對硝基苯酯(PNPP)法測定堿性磷酸酶(ALP)活性、茜素紅S鈣染法檢測礦化結節(jié)形成數目、鹽酸脫鈣法檢測礦化結節(jié)鈣含量、SYBR Green I嵌和熒光法進行real time PCR測定基因Runx2、IGF-1以及IGF-1R的表達水平。 結果：在含11 mmol/L葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代大鼠顱骨成骨細胞，與5.5 mmol/L葡萄糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代大鼠顱骨成骨細胞比較，細胞的增殖

3、、堿性磷酸酶活性、鈣化結節(jié)形成的數目、鈣化結節(jié)中的鈣含量都明顯增加，并有統(tǒng)計學意義；在更高葡萄糖濃度培養(yǎng)基(22，44 mmol/L)中培養(yǎng)原代大鼠顱骨成骨細胞，成骨細胞的增殖、堿性磷酸酶活性、鈣化結節(jié)形成的數目、鈣化結節(jié)中的鈣含量以劑量依賴的形式明顯減少，并有統(tǒng)計學意義。用不同濃度的二甲雙胍干預后，在一定濃度范圍內，二甲雙孤能夠促進5.5 mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)的成骨細胞的增殖，ALP活性，礦化小結形成及鈣沉積；高糖條件下，二甲雙

4、孤同樣促進成骨細胞增殖，ALP活性，礦化小結形成及鈣沉積；進一步，我們評價了在5.5mmol/L、11mmol/L、44 mmol/L的葡萄糖濃度下二甲雙胍(0、10、40、160、320、640μmol/L)干預后的細胞基因Runx2、IGF-1、IGF-1R的表達水平。與5.5mmol/L的葡萄糖比較，11mmol/L葡萄糖明顯促進Runx2、 IGF-1的表達，44mmol/L葡萄糖明顯抑制Runx2、IGF-1、IGF-1R的表

5、達；二甲雙胍能夠顯著促進三種不同葡萄糖濃度下的成骨細胞的Runx2、IGF-1的表達，而對IGF-1R不產生影響。 結論：本研究證實葡萄糖對成骨細胞的增殖，分化與礦化的影響以劑量依賴的形式產生雙向影響；二甲雙胍在一定的濃度范圍內能夠對原代成骨細胞有直接的成骨作用，能夠逆轉高濃度的葡萄糖對成骨細胞功能的損害，這種成骨作用可能部分通過促進Runx2和IGF-1基因的表達。 第二部分二甲雙胍對高糖環(huán)境大鼠顱骨成骨細胞氧化應激和

6、凋亡的影響 目的：探討高糖對大鼠顱骨成骨細胞氧化應激和凋亡的影響以以及二甲雙胍對高糖誘導的大鼠顱骨成骨細胞氧化應激和凋亡的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細胞，分別給予不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基：生理濃度葡萄糖(5.5mmol/L)以及高濃度葡萄糖(11、22、44 mmol/L)，在此基礎上用不同濃度的二甲雙胍(0、10、40、160、320、640μmol/L)干預體外培養(yǎng)的原代大鼠顱骨成骨細胞，運用DCFH-DA作為

7、熒光探針，采用流式細胞檢測技術檢測細胞內細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平，Annexin V-FITC/PI雙染色分析細胞早期凋亡率。 結果：與5.5mmol/L的葡萄糖比較，11mmol/L葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代大鼠顱骨成骨細胞，細胞內活性氧簇(ROS)的形成和細胞調亡的發(fā)生略有減少，但沒有統(tǒng)計學意義；在更高的葡萄糖濃度下的培養(yǎng)基(22、44mmol/L)中培養(yǎng)原代大鼠成骨細胞