大鼠卵巢組織直接覆蓋式玻璃化冷凍保存和自體移植的研究.pdf

1、隨著惡性腫瘤診治技術的不斷進展，腫瘤患者預后明顯改善，生存率顯著提高。腫瘤治療領域的進步很大程度上得益于大劑量聯(lián)合化療和放療等治療手段的不斷改進。然而卵巢對具有細胞毒性的藥物特別是烷化劑和電離輻射相當敏感，處于兒童期、青少年期和成年期的女性患者接受上述治療后，卵泡大量丟失使卵巢儲備功能受到極大的損傷。卵巢是女性重要的生殖內分泌器官，能夠產生性激素、維持內分泌及生成卵子，它的損害會導致閉經、月經不調、性欲減退、第二性征不發(fā)育、卵巢早衰和不

2、育等嚴重臨床后果。卵巢組織的冷凍保存及移植正成為因大劑量放化療等因素引起卵巢衰竭的患者保留卵巢內分泌及生殖功能最具前景的選擇。目前，卵巢組織的保存主要有傳統(tǒng)的慢速凍存法和玻璃化冷凍法。雖然前者已經取得了一系列的成果，但是這種方法需要程序冷凍儀精密控溫，液氮消耗量大，所需時間長，費用較高，且卵巢組織結構較致密，含有多種不同類型的細胞，對冷凍平衡要求各不相同而且差異較大。玻璃化冷凍技術是近10多年來發(fā)展起來的一項冷凍保存新技術，它簡單、經濟

3、，不會因為細胞內冰晶的形成而使細胞受到損傷，較傳統(tǒng)的程序化冷凍有諸多優(yōu)勢。但玻璃化冷凍技術需要高濃度的冷凍保護劑(CPA)，而高濃度的CPA對組織細胞有一定的毒性作用，CPA的細胞毒性作用是冷凍生物學的主要限制因素之一。如何既降低CPA的細胞毒性，減少作用的時間，又促進滲透性CPA充分進入組織和細胞內達到有效保護濃度，提高玻璃化冷凍效果，是當前的研究熱點。Chen報道直接覆蓋式玻璃化冷凍法—Directcovervitrificatio

4、n(DCV)，即用較低濃度冷凍保護液且組織與液氮直接接觸，應用于保存小鼠卵巢組織并取得滿意的效果，但在其他動物和人類的卵巢組織中的應用尚未見報道。 促性腺激素釋放激素類似物(GnRHa)是人工合成的促性腺激素釋放激素，具有較強的性腺抑制作用。近年來國內外有許多研究應用GnRHa旨在抑制卵巢排卵、卵泡發(fā)育，在未成熟卵泡占優(yōu)勢的情況，將抗癌藥的影響減少到最低限度。目前認為化療期間聯(lián)合應用GnRHa有助于卵巢功能的保護并有利于今后生育

5、功能的恢復。在卵巢組織冷凍保存的研究中發(fā)現(xiàn)，原始卵泡更能耐受冷凍復蘇的過程，而初級卵泡等生長卵泡更易發(fā)生冷凍損傷。如果在獲取卵巢組織前應用GnRHa，抑制卵泡的募集、發(fā)育，使卵泡盡可能地停留在原始卵泡階段，是否有利于有利于更多的卵泡渡過低溫冷凍期？從而減少卵巢組織的冷凍損傷？國內外的文獻均無相關報道。 本研究以雌性性成熟SD大鼠為研究對象，采用直接覆蓋式玻璃化冷凍方法，并設計了三種濃度的冷凍保護液，通過組織學、組織熒光活/死性染

6、色(Live/DeadAssay)、TUNEL、透射電鏡檢測方法，比較與常規(guī)玻璃化冷凍方法對卵巢組織保存效果間的差別并探索直接覆蓋式玻璃化冷凍最佳冷凍液濃度；初步探討GnRHa預處理對大鼠卵巢組織的冷凍損傷的影響，以及自體移植后卵巢功能恢復、卵泡生長和血供建立可能產生的影響。 第一部分、大鼠卵巢組織兩種玻璃化冷凍保存方案的比較研究 目的： 比較大鼠卵巢組織直接覆蓋式玻璃化冷凍和常規(guī)玻璃化冷凍法的冷凍效果，并探索直

7、接覆蓋式玻璃化冷凍的適宜濃度。 方法： (1)將50只SD大鼠隨機分為5組：新鮮對照組，常規(guī)玻璃化冷凍組(CV)，直接覆蓋式玻璃化冷凍組(DCV)，采用3種冷凍保護液濃度分別為DCV1組，DCV2組，DCV3組。 (2)建立大鼠卵巢組織的直接覆蓋式玻璃化冷凍(DCV)和常規(guī)玻璃化冷凍法(CV)保存方案。 (3)各組冷凍復蘇后卵巢組織采用以下方法來評估凍存復蘇效果： ①組織學觀察各級卵泡形態(tài)的變化。

8、 ②熒光染色法觀察卵泡的存活和壞死情況。 ③TUNEL法檢測卵巢組織中卵泡的凋亡情況。 ④透射電鏡觀察卵泡超微結構的改變。 第二部分、大鼠卵巢組織自體移植的實驗研究 目的： 建立大鼠自體移植模型，觀察新鮮卵巢組織片和各凍融組卵巢組織異位移植后的生長情況，分析不同冷凍方案對卵巢組織移植后生長的影響，從而進一步判斷各冷凍方案的優(yōu)劣。 方法： (1)各組卵巢組織進行冷凍保存、復蘇

9、后，自體移植至兩側腹股溝區(qū)肌肉層內。A(CV移植組)，B1(DCV1移植組)，B2(DCV2移植組)，B3(DCV3移植組)，C(新鮮卵巢組織移植組)，并設D(去勢組)，E(假手術組)作為對照。 (2)通過陰道上皮細胞觀察動情周期恢復時間及恢復率。 (3)移植后4周左右測血清E2，F(xiàn)SH水平。 (4)移植后30天取出移植的卵巢，HE切片觀察移植后卵巢卵泡形態(tài)和卵泡密度。 第三部分、GnRHa預處理對大鼠卵

10、巢組織的冷凍保存及自體移植的影響 目的： 初步探討GnRHa預處理對大鼠卵巢組織的冷凍損傷的影響，以及自體移植后卵巢功能恢復、卵泡生長和血供建立可能產生的影響。 方法： (1)50只SD大鼠隨機分為4組，A組(GnRHa組)：術前5周每隔30天給予大鼠皮下注射GnRHa0.25mg，共兩次；B組(對照組)：皮下注射注射生理鹽水；C組：假手術組；D組：去勢組。 (2)GnRHa用藥后5周評估：血E2

11、，F(xiàn)SH水平；HE切片觀察卵泡數(shù)目和各級卵泡比例的變化。 (3)冷凍復蘇后卵巢組織的評估： ①組織學觀察卵泡形態(tài)和其中形態(tài)正常的各級卵泡比例。 ②熒光染色法觀察卵泡的存活和壞死情況。 ③TUNEL法檢測卵巢組織中卵泡的凋亡率。 (4)分別在移植后第3天，第7天，第14天，第30天，第60天回收移植物。 ①HE切片觀察卵巢組織切片中卵泡的形態(tài)，比較各時間點各組不同階段卵泡所占的比例，動態(tài)觀察

12、移植物中卵泡啟動生長的情況。 ②免疫組化法檢測移植物中各時間點VEGF蛋白的表達 全文結論： (1)以7.5％EG+7.5％DMSO+DPBS/15％EG+15％DMSO+DPBS為冷凍保護液結合直接覆蓋式玻璃化技術(DCV)是適合大鼠卵巢組織凍存的理想方案，優(yōu)于常規(guī)玻璃化冷凍法。 (2)各凍存組的卵巢組織自體移植后可以存活并具有與新鮮卵巢組織相接近的激素分泌能力。 (3)大腿根部肌肉層作為移植部