大鼠卵巢組織冷凍保存和自體移植的研究.pdf

1、凍融卵巢移植技術(shù)是將獲得的卵巢皮質(zhì)切成片狀，冷凍復(fù)蘇后移植到受體一定部位，誘發(fā)卵泡發(fā)育成熟。雖然卵巢組織的冷凍保存在近年取得了很大進(jìn)展，但該技術(shù)仍處于研究階段，尚不能廣泛應(yīng)用于臨床。如何提高凍融后卵巢組織顆粒細(xì)胞的發(fā)育潛能，降低其凋亡的發(fā)生，促進(jìn)卵巢血管生成因子的生成以利于卵泡存活和發(fā)育，是卵巢組織凍存和移植需要解決的問題。本研究以大鼠為動物模型分三個部分對程序降溫慢速冷凍法對卵巢原始、初級卵泡的影響以及促性腺激素FSH對體外培養(yǎng)和自體

2、移植卵巢組織VEGFmRNA表達(dá)和卵泡生長發(fā)育的作用進(jìn)行初步探討。 第一部分程序降溫冷凍和復(fù)蘇對大鼠卵巢原始卵泡、初級卵泡和卵巢組織VEGFmRNA表達(dá)的影響 目的：通過觀察凍融大鼠卵巢組織在體外培養(yǎng)中原始卵泡和初級卵泡的形態(tài)以及卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞凋亡情況，探討凍融過程對原始卵泡和初級卵泡存活以及VEGFmRNA表達(dá)的影響。 方法：將4-6周齡性未成熟的S-D雌性大鼠的新鮮卵巢組織和程序降溫慢速冷凍方法凍融后卵巢

3、組織，作為新鮮組和凍融組，體外培養(yǎng)24小時作為新鮮培養(yǎng)組和凍融培養(yǎng)組。HE染色，組織學(xué)觀察卵泡形態(tài)；TuNEL方法檢測卵泡凋亡；RT-PCR方法測定卵巢組織VEGFmRNA表達(dá)。 結(jié)果：(1)凍融組形態(tài)正常的原始卵泡與新鮮組相比沒有顯著差異(P>0.05)，但形態(tài)正常的初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡百分率顯著低于新鮮組(P<0.01)。凍融培養(yǎng)組與新鮮培養(yǎng)組相比，原始和初級卵泡形態(tài)正常百分率都有顯著下降(P<0.01)。(2)凍融

4、組中卵母細(xì)胞損傷的初級卵泡和顆粒細(xì)胞損傷的初級卵泡均高于新鮮組。經(jīng)體外培養(yǎng)后，凍融卵巢原始卵泡和初級卵泡中卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞損傷卵泡百分率較新鮮培養(yǎng)組織都有顯著增加(P<0.01)。(3)新鮮和凍融卵巢組織原始卵泡凋亡率和初級卵泡凋亡率沒有差異，但經(jīng)體外培養(yǎng)后，凍融卵巢原始卯泡和初級卵泡凋亡率，以及卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞凋亡牢較新鮮培養(yǎng)組織都有顯著增加(P<0.01)。(4)培養(yǎng)24h后凍融卵巢組織VEGF mRNA表達(dá)有所下降。

5、結(jié)論：(1)凍融過程對原始卵泡和生長期卯泡都可造成一定程度的損傷，隨著卵泡發(fā)育階段的增加，損傷的程度加重。(2)凍融過程誘導(dǎo)卵泡凋亡的發(fā)生，凋亡可能是冷凍損傷的機(jī)制之一。(3)凍融過程可降低卵巢組織VEGF mRNA的表達(dá)。 第二部分卵泡刺激素FSH對體外培養(yǎng)中大鼠顆粒細(xì)胞凋亡和卵巢組織VEGFmRNA表達(dá)的影響 目的：通過在培養(yǎng)液中添加卵泡刺激素FSH，探討FSH對體外培養(yǎng)中大鼠顆粒細(xì)胞凋亡和卵巢組織VEGFmRNA表

6、達(dá)的影響。 方法：分別將新鮮卵巢和凍融卵巢卵泡顆粒細(xì)胞分離出來，體外培養(yǎng)4天，對比培養(yǎng)液中添加FSH與未添加FSH條件下顆粒細(xì)胞凋亡率和培養(yǎng)上清液VEGF濃度。在新鮮和凍融卵巢組織培養(yǎng)中對比培養(yǎng)液中添加FSH與未添加FSH條件下卵巢組織VEGFmRNA的表達(dá)。 結(jié)果：(1)培養(yǎng)液中添加FSH后，凍融顆粒細(xì)胞凋亡率降低。(2)凍融顆粒細(xì)胞分泌VEGF減少，無論是新鮮顆粒細(xì)胞還是凍融顆粒細(xì)胞，在培養(yǎng)液中添加10ng/mlFS

7、H都可使VEGF分泌增加(P<0.05)。(3)培養(yǎng)液中添加FSH后，新鮮和凍融組卵巢組織 VEGF mRNA 表達(dá)增加(P<0.05)。 結(jié)論：(1)培養(yǎng)液中添加10ng/mlFSH，可減少從新鮮和凍融卵泡分離的顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)中細(xì)胞的凋亡。(2)培養(yǎng)液中添加10ng/ml FSH，增加從新鮮和凍融卵泡分離的顆粒細(xì)胞分泌VEGF水平，提高體外培養(yǎng)新鮮和凍融卵巢組織VEGFmRNA表達(dá)。 第三部分凍融大鼠卵巢組織自體移

8、植的實(shí)驗(yàn)研究 目的：建立大鼠自體移植模型，探討促性腺激素FSH對凍融卵巢移植卵血管內(nèi)皮生長因子VEGF、卵泡存活和發(fā)育的影響。 方法：將凍融卵巢組織自體移植回肌肉中預(yù)制的肉芽組織中，一組每日注射FSH，另一組每日注射生理鹽水，觀察兩組卵巢中卵泡數(shù)量和各級卵泡比例，以及VEGF mRNA和PCNA表達(dá)。 結(jié)果：(1) 移植后卵巢組織卵泡數(shù)顯著下降。移植注射FSH組的初級卵泡和次級卵泡教墨比移植注射鹽水組增加 (P<

9、0.05)。(2) 移植后原始卵泡百分率下降，初級卵泡和次級卵泡百分率顯著上升(P<0.01)。移植注射FSH組與移植注射鹽水組相比，原始卵泡百分率也有下降，初級卵泡百分率有增加趨勢。(3)移植48h后，兩個移植組VEGF mRNA 水平均有升高，但移植注射FSH組和移植注射鹽水組之間沒有差別。移植10天后，移植注射鹽水組 VEGF mRNA 水平降低而移植注射FSH組仍保持較高水平。(4)移植+FSH組PCNA陽性表達(dá)初級卵泡百分率較