家兔卵巢組織冷凍保存、體外培養(yǎng)及移植的研究.pdf

1、第一部分:
　　 目的：
　　 觀察4種冷凍復(fù)蘇方法對(duì)家兔卵巢組織形態(tài)學(xué)及卵母細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響，探討適宜的卵巢組織冷凍復(fù)蘇方案。
　　 方法：
　　 將12只健康日本大耳白家兔隨機(jī)分為4組，分別采用PROH及DMSO慢速程序化冷凍和DMSO+PROH及DMSO+EG玻璃化冷凍方法凍存家兔卵巢組織，液氮保存一月后復(fù)蘇，分別行HE染色及免疫組化染色，觀察冷凍復(fù)蘇后卵巢組織結(jié)構(gòu)和各級(jí)卵泡形態(tài)學(xué)的改變及始基

2、和初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞PCNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.各冷凍組合并后計(jì)算始基卵泡的形態(tài)正常率為72.70[％]，初級(jí)卵泡的形態(tài)正常率為52.77[％]，二者比較，差異有顯著性。4個(gè)冷凍組均可見(jiàn)卵巢組織結(jié)構(gòu)受損的表現(xiàn)，鏡下可見(jiàn)部分卵泡與周圍間質(zhì)細(xì)胞分離，間質(zhì)細(xì)胞連接變得疏松，排裂紊亂，有裂隙形成。
　　 2.免疫組化染色結(jié)果顯示冷凍組中PROH組始基及初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞PCNA的陽(yáng)性率最高達(dá)，玻璃化組2次之

3、，與新鮮對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性，而DMSO組及玻璃化組1PCNA陽(yáng)性率較新鮮對(duì)照組明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.4種冷凍復(fù)蘇方法均對(duì)家兔卵巢組織結(jié)構(gòu)造成一定程度的損傷，使各級(jí)卵泡的形態(tài)正常率明顯下降，出現(xiàn)間質(zhì)受損的表現(xiàn)。
　　 2.PROH慢速程序化冷凍法明顯優(yōu)于DMSO慢速程序化法及玻璃化法，較適合卵巢組織中始基卵泡的保存。
　　 3.凍存卵巢組織對(duì)初級(jí)卵泡的影響大于始基卵泡。
　　 4.

4、PROH慢速程序化冷凍及DMSO+EG玻璃化冷凍能較好地保持家兔卵巢組織中始基及初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞的增殖活性。
　　 第二部分:
　　 目的：
　　 觀察PROH慢速程序化冷凍及DMSO+EG玻璃化冷凍對(duì)家兔卵巢組織超微結(jié)構(gòu)、ER和MHC-Ⅱ類抗原表達(dá)及卵泡細(xì)胞增殖活性的影響，判斷復(fù)蘇后卵巢組織抗原性和免疫原性是否發(fā)生改變，為今后卵巢組織移植及體外培養(yǎng)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、將健康

5、日本大耳白家兔9只隨機(jī)分為3組，1組為新鮮對(duì)照組，另2組為冷凍組。冷凍組分別采用PROH慢速程序化冷凍及DMSO+EG玻璃化凍存方案凍存家兔卵巢組織。
　　 2、復(fù)蘇后透射電鏡觀察兩種冷凍方法對(duì)家兔卵巢組織超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 3、SP免疫組化法觀察兩種方法對(duì)家兔卵巢組織ER及MHC-Ⅱ類抗原表達(dá)的影響。
　　 4、機(jī)械性分離新鮮組及冷凍組復(fù)蘇的組織塊，分離下的卵泡按直徑的大小，有5層以上顆粒細(xì)胞包裹的大次級(jí)卵

6、泡。每組分別取20個(gè)形態(tài)正常的OGC，行3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷摻入試驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、PROH組始基卵泡卵母細(xì)胞部分線粒體腫脹，呈空泡狀；部分線粒體形態(tài)尚正常；細(xì)胞核形態(tài)正常，核膜完整，界線清晰；顆粒細(xì)胞核膜完整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體形態(tài)正常,細(xì)胞間縫隙連接完好。DMSO+EG組，始基卵泡卵母細(xì)胞線粒體腫脹，細(xì)胞器崩解；細(xì)胞形態(tài)尚可，邊界清晰，核膜完整。周圍顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體尚可，間質(zhì)細(xì)胞線粒體腫脹明顯，呈空泡狀。

7、r>　　 2、免疫組化結(jié)果顯示，兩冷凍組復(fù)蘇后家兔卵巢組織ER的表達(dá)與新鮮對(duì)照組比較，無(wú)明顯變化。DMSO+EG玻璃化冷凍組MHC—Ⅱ類抗原的表達(dá)與新鮮對(duì)照組比較明顯下降，PROH組無(wú)明顯變化。
　　 3、兩冷凍組復(fù)蘇后小OGC的cpm值與新鮮對(duì)照組比較，無(wú)明顯差異，而大OGC的cpm值較新鮮對(duì)照組明顯下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.PROH慢速程序化冷凍對(duì)家兔卵巢組織超微結(jié)構(gòu)的影響小于DMSO+EG玻璃化冷凍

8、。
　　 2.兩種冷凍復(fù)蘇方法，對(duì)家兔卵巢組織ER的表達(dá)均無(wú)明顯影響。
　　 3.DMSO+EG玻璃化冷凍復(fù)蘇明顯降低了卵巢組織的免疫原性。
　　 4.兩種冷凍復(fù)蘇方法對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的小OGC增殖活力無(wú)明顯影響，這些卵泡體外生長(zhǎng)和成熟，可能更容易成功。多層顆粒細(xì)胞包裹的大OGC即便形態(tài)正常，其增殖活性也明顯受到抑制。
　　 第三部分:
　　 目的：
　　 探討適宜的卵巢組織體外培養(yǎng)方法。<

9、br>　　 方法：
　　 1.無(wú)菌條件下取新鮮家兔卵巢組織，復(fù)蘇PROH慢速程序化冷凍保存的家兔卵巢組織，分別采用部分分離培養(yǎng)及組織塊培養(yǎng)方法體外連續(xù)培養(yǎng)14d，作為新鮮部分分離培養(yǎng)組、新鮮組織塊培養(yǎng)組、冷凍部分分離培養(yǎng)組、冷凍組織塊培養(yǎng)組。
　　 2.每隔1天倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)情況，并收集組織培養(yǎng)液500μl待測(cè)E2，同時(shí)補(bǔ)入新鮮培養(yǎng)液500μl。采用酶免法檢測(cè)各組E2分泌量的變化。
　　 培養(yǎng)14d結(jié)束時(shí)

10、機(jī)械性分離各組卵巢組織，將形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，顆粒細(xì)胞連續(xù)，折光性好的大OGC和小OGC每組分別各取20個(gè)，進(jìn)行3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷摻入試驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.倒置顯微鏡下新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)組均可見(jiàn)單層顆粒細(xì)胞包裹的小卵泡，連續(xù)培養(yǎng)14d，未見(jiàn)明顯生長(zhǎng)，卵泡內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒，有退化壞死的跡象。
　　 2.新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)組，培養(yǎng)14d后機(jī)械性分離卵巢組織均可見(jiàn)竇卵泡形成，進(jìn)一步分離得到GV期卵子，未得

11、到MⅡ期卵子。
　　 3.新鮮及冷凍組織塊培養(yǎng)組，14d培養(yǎng)結(jié)束時(shí)未見(jiàn)到有明顯竇腔的卵泡形成。
　　 4.各培養(yǎng)組E2分泌量的變化：
　　 新鮮組織塊組，第6天E2分泌量達(dá)高峰，第8天開(kāi)始逐漸下降；冷凍組織塊組E2分泌量持續(xù)下降；而新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)組E2分泌持續(xù)上升。
　　 5.3H標(biāo)記胸腺嘧啶核苷摻入試驗(yàn)結(jié)果：新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)組和新鮮組織塊組所得到的小OGC其cpm值均無(wú)明顯差異，而冷凍組織

12、塊得到小OGC的cpm值較以上各組明顯降低。
　　 6.冷凍組織塊組培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，未得到形態(tài)正常的大OGC。新鮮及冷凍部分分離培養(yǎng)所得到的形態(tài)正常的大OGC其cpm值無(wú)明顯差異，而新鮮組織塊組所得到的大OGC的cpm值較上兩組明顯下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.部分分離法體外培養(yǎng)新鮮及冷凍的家兔卵巢組織明顯優(yōu)于組織塊培養(yǎng)法。體外培養(yǎng)14d，前者培養(yǎng)液中E2呈上升趨勢(shì)，有竇卵泡形成；后者隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)E2呈下降趨勢(shì)

13、，未見(jiàn)竇卵泡形成。
　　 2.新鮮及冷凍組織部分分離培養(yǎng)所得到的形態(tài)正常的大小OGC均有良好的增殖活性，說(shuō)明PROH慢速程序化冷凍較好地保存了存活卵泡的體外發(fā)育潛能。
　　 3.該培養(yǎng)系統(tǒng)不適合家兔卵巢組織始基及初級(jí)卵泡的體外培養(yǎng)。
　　 4.冷凍卵巢組織更不適合組織塊培養(yǎng)，所得到的形態(tài)正常的小OGC增殖活性差，未得到形態(tài)正常的大OGC。
　　 第四部分:
　　 目的：
　　 探討適宜的卵

14、巢組織移植部位，觀察移植成活物的生理功能。
　　 方法：
　　 1.選健康大耳白家兔20只隨機(jī)分為對(duì)照組、去勢(shì)組、移植組。
　　 2.移植組選宮旁闊韌帶為移植部位，將切下的雙側(cè)卵巢去除髓質(zhì)，切成1×1×1mm3大小的組織塊植入左側(cè)闊韌帶的漿膜下，移植術(shù)后隔日肌注HMG 10IU/天，至術(shù)后半月。去勢(shì)組切除雙側(cè)卵巢。
　　 3.術(shù)后第2天開(kāi)始隔日行陰道脫落細(xì)胞學(xué)涂片，觀察雌激素水平的變化，至術(shù)后一個(gè)半月。<

15、br>　　 4.術(shù)后一月開(kāi)始，每只家兔每隔5日，連續(xù)3次取耳緣靜脈血2ml，酶免法測(cè)定血清E2水平。
　　 5.術(shù)后1個(gè)半月再次開(kāi)腹，取對(duì)照組子宮內(nèi)膜及卵巢；取去勢(shì)組子宮內(nèi)膜；取移植組的成活移植物及子宮內(nèi)膜，做HE染色行組織形態(tài)學(xué)觀察。
　　 6.移植成活的卵巢組織及對(duì)照組卵巢組織行SP免疫組化染色，觀察PCNA及VEGF表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.陰道脫落細(xì)胞學(xué)涂片結(jié)果：對(duì)照組陰道細(xì)胞涂片顯

16、示細(xì)胞大，為多邊型，胞漿稀薄透明，核小固縮，為雌激素作用的表現(xiàn)；去勢(shì)組術(shù)后4—6天開(kāi)始，陰道細(xì)胞涂片顯示細(xì)胞呈圓形，核大圓形或橢圓形，核漿比增加，為低雌激素水平的表現(xiàn)；移植組1只術(shù)后死亡，剩余家兔術(shù)后4—6天開(kāi)始陰道細(xì)胞涂片顯示低雌激素水平，7只家兔術(shù)后10—20天重新恢復(fù)雌激素作用的表現(xiàn)，另2只未恢復(fù)。
　　 2.E2測(cè)定結(jié)果：移植組7只家兔術(shù)后1個(gè)月血清E2水平恢復(fù)正常，與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性；另2只家兔E2未恢復(fù)正

17、常。去勢(shì)組家兔E2水平明顯降低，與對(duì)照組比較，差異有顯著性。
　　 3.HE染色子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)觀察：去勢(shì)組：子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞由單層柱狀細(xì)胞組成，腺體數(shù)量少，形態(tài)萎縮，間質(zhì)細(xì)胞排裂緊密。移植組：E2水平恢復(fù)的7只家兔，子宮內(nèi)膜表層細(xì)胞呈鋸齒狀，由假?gòu)?fù)層柱狀細(xì)胞構(gòu)成，腺體數(shù)量多，排列緊密，形態(tài)飽滿，間質(zhì)細(xì)胞排列疏松，同對(duì)照組；另2只E2低水平的家兔子宮內(nèi)膜同去勢(shì)組。
　　 4.移植組卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察：移植組6只闊韌帶處找到

18、成活的卵巢組織，外觀見(jiàn)移植的卵巢組織被纖維組織及脂肪組織包裹，HE染色鏡下可見(jiàn)形態(tài)正常的各級(jí)卵泡及大量新生血管。
　　 5.免疫組化結(jié)果：移植組卵巢組織始基及初級(jí)卵泡卵母細(xì)胞PCNA表達(dá)陽(yáng)性率為78.67[％]與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，VEGF的表達(dá)部位及表達(dá)強(qiáng)度與對(duì)照組比較也無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.子宮旁闊韌帶處血供豐富，內(nèi)環(huán)境接近卵巢生理狀態(tài)，移植手術(shù)操作簡(jiǎn)便，較適合卵巢組織移植，結(jié)合移植術(shù)后應(yīng)用