玻璃化法冷凍保存豬關(guān)節(jié)軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：尋找更佳的關(guān)節(jié)軟骨玻璃化保存程序，并將玻璃化法與其他冷凍方法(慢速梯度降溫法、直接液氮冷凍法)比較，探討玻璃化法保存關(guān)節(jié)軟骨的可行性和優(yōu)越性。 方法： 實(shí)驗(yàn)1.骨軟骨移植物在玻璃化液中浸泡時(shí)間的篩選：以豬為研究對(duì)象，無菌條件下在內(nèi)外側(cè)股骨髁關(guān)節(jié)面負(fù)重區(qū)切取圓柱性骨軟骨塊，其直徑約為4.5mm，骨及所帶軟骨下骨全長約5mm，共32枚，隨機(jī)分為四組，每組8枚：新鮮組(Ⅰ組)為對(duì)照組，其余各組在412經(jīng)梯度玻璃化溶液：1

2、/3濃度VS1→2/3濃度VS1→VS1(VS1為含20.5％二甲基亞砜、15.5％乙酰胺、10％1,2-丙二醇、6％聚乙二醇(8000)的玻璃化溶液)逐級(jí)浸泡,總時(shí)間分別為30min(Ⅱ組)、60min(Ⅲ組)、90min(Ⅳ組)，然后以最快速度直接投入液氮中保存2周，復(fù)溫后用熒光染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，以選擇較合適的浸泡時(shí)間。 實(shí)驗(yàn)2.采用實(shí)驗(yàn)1篩選的玻璃化法與慢速梯度降溫法、直接液氮冷凍法的比較研究：取材同實(shí)驗(yàn)1，共取骨軟骨塊

3、120枚，隨機(jī)分為新鮮對(duì)照組(A組)18枚、玻璃化組(B組)34枚、慢速梯度降溫組(C組)34枚、直接液氮冷凍組(D組)34枚。慢速梯度降溫組將標(biāo)本在4℃ 10％DSMO浸泡30min，然后在程序冷凍儀中以-1℃/min的速率降溫至-4℃維持45min、-8℃維持30min、-40℃維持10min，最后放入-80℃保存。直接液氮冷凍組不經(jīng)預(yù)處理直接將標(biāo)本投入液氮中保存。各實(shí)驗(yàn)組在2周、8周時(shí)間點(diǎn)分別取8枚進(jìn)行組織學(xué)、組織化學(xué)(番紅O染色

4、顯示軟骨基質(zhì)蛋白多糖PG的變化)檢測(cè)，8枚進(jìn)行細(xì)胞存活率(熒光染色法)檢測(cè)，在2周點(diǎn)取2枚行軟骨縱斷面掃描電鏡(SEM)檢查，了解軟骨基質(zhì)的損傷情況，新鮮組在取材半小時(shí)內(nèi)檢測(cè)指標(biāo)。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)1.各組的軟骨細(xì)胞存活率依次為：Ⅰ組96.60％、Ⅱ組75.24％、Ⅲ組64.22％、Ⅳ組51.58％。各實(shí)驗(yàn)組(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)均下降，各組間兩兩比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅱ組即30分鐘組軟骨細(xì)胞存活率明顯高于其余兩實(shí)驗(yàn)組，證實(shí)

5、30分鐘是較合適的浸泡時(shí)間。 實(shí)驗(yàn)2.①PG的變化：C組即慢速梯度降溫組PG(IOD值)減少明顯，2周點(diǎn)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，8周點(diǎn)與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其它兩組PG下降不明顯，在2周和8周點(diǎn)與對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②軟骨細(xì)胞存活率：隨保存時(shí)間延長各實(shí)驗(yàn)組均程度不同下降，B組(玻璃化組)2周75.24％，8周62.33％：C組(慢速梯度降溫組)2周56.15％，8周37.78％：D組(直接液氮冷凍組)存活率極低，

6、2周和8周均不到5％。B組與C組比較，在2周和8周點(diǎn)差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證實(shí)玻璃化法比慢速梯度降溫法能獲得更高的軟骨細(xì)胞存活率。③SEM檢查：軟骨基質(zhì)的損傷程度：直接液氮冷凍組>慢速梯度降溫組>玻璃化組。 結(jié)論： 1.軟骨冷凍損傷客觀存在不可完全避免，但可被減弱。通過軟骨冷凍保存方法的改進(jìn)，可以提高冷凍保存后軟骨細(xì)胞存活率，減少軟骨基質(zhì)的損傷。 2.與慢速梯度降溫法相比，玻璃化法能顯著提高冷凍保存后軟骨細(xì)胞存