玻璃化冷凍誘導(dǎo)卵巢ERS的作用研究.pdf

1、目的：通過(guò)研究卵巢凍存過(guò)程中及FSH干預(yù)后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)分子伴侶GRP78、凋亡相關(guān)蛋白CHOP、caspase-12的表達(dá)水平,探討凍存過(guò)程中是否激活了卵巢內(nèi)ERS,后期卵巢中存在的卵泡丟失是否與ERS途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián),以及FSH對(duì)凍存過(guò)程中ERS的作用影響。
　　方法：領(lǐng)取4周齡ICR雌性小鼠,取其雙側(cè)卵巢,剝離外膜后縱向?qū)η谐蓛砂?以半卵巢的形式進(jìn)行培養(yǎng)。首先進(jìn)行對(duì)照組部分建模,包括衣霉素(TM)誘導(dǎo)卵巢ERS

2、模型的建立(包括新鮮對(duì)照組、凍存組、TM濃度梯度組:1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml)和?；切苋パ跄懰徕c(TUDCA)緩解卵巢ERS模型的建立(包括新鮮對(duì)照組、TUDCA濃度梯度組:1mM、5mM、10mM)。模型建立后獲取卵巢隨機(jī)分到對(duì)照部分:新鮮組、TM組、TM+TUDCA組;實(shí)驗(yàn)部分:凍存組、凍存+TUDCA組、凍存+FSH組、保護(hù)劑滲透組、保護(hù)劑滲透+TUDCA組、保護(hù)劑滲透+FSH組中

3、。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各分組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶分子GRP78、凋亡相關(guān)蛋白CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)水平,Real-time-PCR技術(shù)檢測(cè)GRP78、CHOP、caspase-12mRNA表達(dá)水平。TUNEL法檢測(cè)各組卵巢內(nèi)細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TM誘導(dǎo)卵巢ERS模型建立各組中GRP78表達(dá)水平結(jié)果顯示:凍存組分別與5-1、20-1、30-1組兩兩比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在TUDC

4、A緩解卵巢ERS模型建立過(guò)程中以新鮮組作為陰性對(duì)照,以10μg/mLTM誘導(dǎo)組作為陽(yáng)性對(duì)照,將各濃度TUDCA與10μg/mLTM共同作用于小鼠卵巢培養(yǎng)12h,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組卵巢中GRP78蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示,隨著TUDCA濃度的增加,GRP78蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì),在TUDCA濃度達(dá)到10mM時(shí)卵巢內(nèi)GRP78表達(dá)水平及細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)到新鮮組水平。建模完成后免疫組織化學(xué)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)部分凍存組卵巢內(nèi)GRP78、CHOP

5、及Caspase-12表達(dá)水平顯示:凍存組ERS伴侶分子GRP78表達(dá)水平明顯高于新鮮對(duì)照組,兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);凍存組ERS凋亡相關(guān)蛋白CHOP蛋白表達(dá)水平顯著高于新鮮對(duì)照組,兩組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);凍存組內(nèi)Caspase-12表達(dá)低于新鮮對(duì)照組;而保護(hù)劑滲透組內(nèi)GRP78、CHOP及Caspase-12蛋白表達(dá)水平均高于新鮮對(duì)照組。Real-timePCR結(jié)果顯示:凍存組GRP78、CHOPmRNA表

6、達(dá)水平明顯高于新鮮對(duì)照組,其中CHOP上調(diào)幅度更明顯,而Caspase-12mRNA表達(dá)水平低于新鮮對(duì)照組;保護(hù)劑滲透組中GRP78、CHOP、Caspase-12mRNA表達(dá)水平較新鮮對(duì)照組均有明顯上調(diào)。保護(hù)劑滲透組、凍存組和TM組在添加ERS抑制劑TUDCA后各基因表達(dá)水平均有明顯下降;FSH干預(yù)凍存組后GRP78及Caspase-12表達(dá)水平均高于未干預(yù)凍存組,CHOP表達(dá)水平較凍存組下調(diào);FSH干預(yù)保護(hù)劑滲透組后GRP78表達(dá)水

7、平較未干預(yù)時(shí)上升,而CHOP及Caspase-12的表達(dá)水平則低于未干預(yù)組。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示:凍存組及保護(hù)劑滲透組細(xì)胞凋亡水平均顯著高于新鮮對(duì)照組,其中保護(hù)劑滲透組細(xì)胞凋亡水平高于凍存組,且保護(hù)劑滲透組、凍存組、TM組在添加TUDCA及FSH后,細(xì)胞凋亡水平均明顯降低。
　　結(jié)論：凍存過(guò)程可以誘導(dǎo)卵巢發(fā)生ERS,且ERS抑制劑TUDCA對(duì)其ERS水平有明顯下調(diào)作用。其中保護(hù)劑滲透組內(nèi)ERS較劇烈,細(xì)胞凋亡主要由ERS引起,