程序化冷凍和玻璃化冷凍技術(shù)實(shí)用性的對(duì)比研究.pdf

1、1978年，世界第一例試管嬰兒Louis Brown誕生的消息傳來(lái)，世界各國(guó)的人們集聚無(wú)比興奮的心情與追逐先進(jìn)的欲望，紛紛開(kāi)始開(kāi)展這項(xiàng)技術(shù)。隨著輔助生育技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)的發(fā)展，胚胎冷凍技術(shù)已經(jīng)成為其發(fā)展不可分割的一部分。盡管人類(lèi)的胚胎低溫保存已然成為人類(lèi)輔助生殖中公認(rèn)的技術(shù)，然而植入前胚胎在哪一個(gè)階段實(shí)施低溫冷凍儲(chǔ)藏的效果最佳尚未明了。程序化慢速冷凍法是一項(xiàng)較成熟的冷凍技術(shù)

2、，廣泛的應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域，而目前玻璃化冷凍作為一種新的冷凍保存方法，與傳統(tǒng)的程序慢速冷凍相比顯得更加簡(jiǎn)單快速有效，其在復(fù)蘇率、囊胚形成率、囊胚孵出率等方面都具有一定的優(yōu)勢(shì)。而且玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用的同時(shí)還減少了實(shí)驗(yàn)室的工作量、降低了成本，最大限度的提高了每次促排卵/取卵周期可供嘗試的妊娠次數(shù)，顯示出了更強(qiáng)的實(shí)用性。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)以小鼠4細(xì)胞、8細(xì)胞及囊胚胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以Cryoloop為載體，分別進(jìn)行兩種不同的冷凍方式，探

3、討和對(duì)比兩種冷凍方法對(duì)于不同時(shí)期的小鼠胚胎冷凍效果。
　　方法：
　　1昆明小鼠常規(guī)促排卵，體外受精，分別于 HCG后48~50小時(shí)、60~62小時(shí)和85~96小時(shí)取4細(xì)胞、8細(xì)胞和3至4期囊胚進(jìn)行程序化和玻璃化冷凍。
　　2玻璃化冷凍與復(fù)蘇：胚胎首先用預(yù)平衡液7.5％(v/v) EG、7.5%(v/v)DMSO平衡2分鐘；然后轉(zhuǎn)入15%(v/v) EG、15%(v/v) DMSO、0.65M sucrose的玻璃化冷

4、凍液中，時(shí)間控制在30秒內(nèi)。胚胎復(fù)蘇采用0.33M、0.2M、0M sucrose復(fù)蘇液，梯度稀釋逐步洗脫冷凍保護(hù)劑,平衡時(shí)間分別為2min、3min和5min。
　　3程序化冷凍與復(fù)蘇：胚胎在冷凍液中處理后裝入麥管，置入冷凍儀，起始溫度20℃，以-2℃/min的速度降至-7℃，在-7℃保持5分鐘，人工植冰，保持10分鐘。以-0.3℃/min的速度降至-35℃，以-50℃/min的速度降至-150℃，從程序降溫儀中取出麥管放入液氮

5、中，在液氮內(nèi)將麥管轉(zhuǎn)入麥管盒中，放入胚胎保存液氮。
　　結(jié)果：
　　1.四細(xì)胞組程序化冷凍了104枚胚胎，解凍后存活97，存活率93.2%（97/104），繼續(xù)培養(yǎng)到72小時(shí)后，囊胚形成率為84.5%(82/97),囊胚孵出率65.9%（54/82）。玻璃化冷凍了118枚胚胎，解凍后存活109枚，存活率92.3%（109/118），胚胎繼續(xù)培養(yǎng)到72小時(shí)后，囊胚形成率為84.5(82/97)，囊胚孵出率65.9%（54/82

6、）。兩組4細(xì)胞胚胎在存活率，囊胚形成率，囊胚孵出率的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）
　　2.八細(xì)胞組程序化冷凍了110枚胚胎解凍后存活90枚，存活率81.8%，培養(yǎng)至72小時(shí)后，囊胚形成率為84.4%（76/90），囊胚孵出率為76.3%(58/76)。玻璃化冷凍了112枚胚胎，解凍后存活102枚，存活率91.1%，胚胎培養(yǎng)到72小時(shí)后，囊胚形成率為93.2%（97/112），囊胚孵出率為88.7%（86/97）。兩組8細(xì)胞胚

7、胎在存活率，囊胚形成率，囊胚孵出率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　囊胚組程序化冷凍了101枚胚胎，解凍后存活83枚，存活率82.2%(83/101)，凍融后囊胚孵出率為61.4%（51/83）。玻璃化冷凍了92枚胚胎，解凍后存活85枚，存活率92.4%。凍融后囊胚孵出率為82.4%（70/85）。兩組囊胚分別進(jìn)行玻璃化冷凍與程序化冷凍并解凍后在存活率，囊胚孵出率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　結(jié)論：
　　玻璃化冷凍技術(shù)比程序化冷凍技術(shù)