FSHβ-protamine1融合蛋白構(gòu)建及靶向介導(dǎo)siRNA沉默卵巢顆粒細(xì)胞SMPD1基因的研究.pdf

1、女性的卵巢是產(chǎn)生卵子和分泌性激素的性腺，具有生育和內(nèi)分泌雙重功能，是人類社會(huì)繁衍后代和維持女性健康生理狀態(tài)的重要器官。但卵巢又是一個(gè)對(duì)內(nèi)外環(huán)境變化極敏感的器官，易受各種理化因素的損害。臨床上許多治療措施，如惡性腫瘤病人的放、化療，自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)的免疫抑制治療，以及骨髓移植前的化療都可損傷卵巢，出現(xiàn)月經(jīng)紊亂、圍絕經(jīng)綜合征、不孕甚至卵巢功能永久性衰竭等一系列改變，研究表明化療藥物對(duì)卵巢的損害是不可逆的，暴露于化療藥物的卵

2、巢，其組織病理可顯示出從卵泡數(shù)目的嚴(yán)重減少到缺失，最終引起功能衰竭。據(jù)報(bào)道，64％的成年女性患者經(jīng)歷腫瘤治療后伴隨有一種或多種卵巢功能衰退的癥狀。另一方面，隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，青少年和生育年齡的女性癌癥患者在經(jīng)過治療后，生存率顯著提高。據(jù)估計(jì)，到2010年每250個(gè)成年人當(dāng)中就有一個(gè)是青少年癌癥患者治療后的幸存者，因此在治療疾病的同時(shí)如何保存這些女性的生育和內(nèi)分泌功能越來越成為一個(gè)迫切需要解決的問題。
　　 目前，大量研究表明抗腫瘤

3、治療中導(dǎo)致卵巢功能損害的機(jī)制是細(xì)胞凋亡，由于顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞的凋亡，作為卵巢內(nèi)最基本功能單位的卵泡也隨之消亡，最終導(dǎo)致卵巢生殖與內(nèi)分泌功能的喪失。研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺(ceramide)作為脂質(zhì)第二信使在卵泡細(xì)胞凋亡信號(hào)中扮演重要的角色。在受到傷害刺激后，顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平迅速升高并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且神經(jīng)酰胺水平的增高主要是由于酸性鞘磷脂酶1(Sphingomyelin phosphodiesterase1，SMPD1)的

4、表達(dá)增強(qiáng)以及活化，消解細(xì)胞膜神經(jīng)鞘磷脂所致。研究表明敲除SMPD1基因的小鼠卵母細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)化療藥物誘導(dǎo)凋亡的抵抗。而TILLY等人的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺的拮抗劑神經(jīng)鞘氨醇-1-磷酸鹽(sphingosine1-phosphate,S-1-P)能夠有效抵制由抗腫瘤藥物所誘發(fā)的卵泡丟失。而且用射線對(duì)雌性小鼠進(jìn)行照射前用S-1-P能夠以劑量依賴的方式保護(hù)接受輻射小鼠卵巢的功能，收集在接受放射前使用S-1-P處理過的小鼠卵子進(jìn)行體外受精、胚胎培養(yǎng)

5、結(jié)果顯示受精率與胚胎發(fā)育與正常卵子沒有差異。而我們課題組之前的實(shí)驗(yàn)研究也得出S-1-P能預(yù)防環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)導(dǎo)致的大鼠卵巢功能損害，其抗凋亡作用可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。
　　 上述研究證實(shí)SMPD1是卵巢發(fā)育過程中卵泡池儲(chǔ)備減少和抗腫瘤治療中卵泡凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因素的同時(shí)也為尋求卵巢功能保護(hù)的方法提供了新的作用靶點(diǎn)?？梢岳没蛘{(diào)控技術(shù)手段來沉默SMPD1基因的表達(dá)，阻斷凋亡

6、信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而降低放/化療過程中卵泡凋亡，進(jìn)而達(dá)到卵巢保護(hù)的目的。RNA干擾技術(shù)(RNA Interference)是通過雙鏈小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)介導(dǎo)，序列特異性降解目的基因的信使RNA(mRNA)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后快速、高效、精確沉默基因的表達(dá)，而不影響基因組序列。因此，設(shè)計(jì)利用siRNA技術(shù)沉默SMPD1基因的表達(dá)，阻斷卵泡細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，降低放/化療過程中卵泡凋亡，從而達(dá)到保護(hù)卵

7、巢功能的目的。siRNA作為藥物用于疾病治療，首先需要把siRNA分子在體內(nèi)輸送靶細(xì)胞的胞漿內(nèi)。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的靜脈高壓注射缺乏組織特異性，而局部組織的直接注射在人體內(nèi)實(shí)施也較困難。Song等人利用HIV感染的CD4+T淋巴細(xì)胞表面特異性表達(dá)GP120蛋白的特點(diǎn)，構(gòu)建了抗GP120單克隆抗體與魚精蛋白的融合蛋白，利用魚精蛋白所帶正電荷與帶負(fù)電荷的siRNA結(jié)合，血管內(nèi)注射后，融合蛋白攜帶抗HIV的siRNA進(jìn)入HIV感染的淋巴細(xì)胞，而

8、對(duì)沒有發(fā)生感染的淋巴細(xì)胞沒有影響。
　　 受上述研究啟發(fā)，我們利用卵巢組織顆粒細(xì)胞表面的特異性受體-卵泡刺激素受體(Follicle-Stimulating Hormone Receptor,FSHR)來介導(dǎo)siRNA靶向運(yùn)輸?shù)铰殉步M織發(fā)揮抗凋亡的作用。FSHR主要在初級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞上表達(dá)，隨著卵泡的發(fā)育，顆粒細(xì)胞上FSHR數(shù)量逐步增加，卵泡刺激素(Follicle-Stimulating Hormone，F(xiàn)SH)通過與受體的特

9、異性結(jié)合，并在雌激素和黃體生成素(LuteinizingHormone,LH)的協(xié)同作用下促使卵泡發(fā)育成熟，在正常生理情況下，在其它組織細(xì)胞上尚未發(fā)現(xiàn)FSHR的表達(dá)。在分子結(jié)構(gòu)上,FSH與LH、絨毛膜促性腺激素(Chorionic Gonadotropic,CG)、促甲狀腺激素(Thyroid-StimulatingHormone,TSH)一樣，均由α、β兩個(gè)亞基組成，其中α亞基為上述4種激素所共有，由同一基因編碼，而β亞基則由不同基因

10、編碼，這決定上述分子結(jié)構(gòu)的特異性與生理功能的差異。故理論上設(shè)計(jì)以FSHβ亞基為siRNA載體，實(shí)現(xiàn)特異性靶向介導(dǎo)siRNA進(jìn)入卵巢組織應(yīng)該是可行的。
　　 研究目的：
　　 1.FSHβ亞基與魚精蛋白1融合基因插入質(zhì)粒pcDAN3.1+，構(gòu)建含F(xiàn)SHβ亞基與魚精蛋白1融合基因的重組質(zhì)粒pcDAN3.1+/FSHβ-(GS)-P1。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，構(gòu)建CHO細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)富含正電荷的融合蛋白

11、FSHβ-(GS)-P1。
　　 2.融合蛋白FSHβ-(GS)-P1與針對(duì)小鼠SMPD1基因的siRNA非共價(jià)結(jié)合，靶向介導(dǎo)siRNA沉默卵巢顆粒細(xì)胞SMPD1基因的表達(dá)。
　　 材料與方法：
　　 1.重組質(zhì)粒構(gòu)建：在Pubmed中查出小鼠FSHβ亞基和魚精蛋白1的編碼序列，去除FSHβ亞基編碼序列終止密碼子后，通過柔性肽(GSGGSG)編碼序列與魚精蛋白1的編碼序列5'端拼接在一起，獲得融合蛋白FSHβ-(

12、GS)-P1的編碼序列。同時(shí)在融合蛋白編碼序列5'端加入KOZAK序列(GCCACC)及甘氨酸編碼序列(GGT)，3'端加入6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的編碼序列，整個(gè)編碼序列的5'和3'端再分別加入ECORⅠ和BamHI限制性酶切位點(diǎn)及3個(gè)保護(hù)性堿基。化學(xué)合成該重組的目的基因，插入質(zhì)粒pcDAN3.1+，獲得重組質(zhì)粒pcDAN3.1+/FSHβ-(GS)-P1。
　　 2.重組質(zhì)粒pcDAN3.1+/FSHβ-(GS)-P1轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩

13、選陽性受體菌，進(jìn)行重組質(zhì)粒DNA擴(kuò)增、提取及酶切電泳鑒定。
　　 3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418(1000μg/ml)篩選出穩(wěn)定分泌表達(dá)FSHβ/P1融合蛋白的單克隆CHO重組細(xì)胞。通過RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)、Western blot、ELISA鑒定融合蛋白的表達(dá)。
　　 4.含F(xiàn)SHβ/P1融合蛋白的CHO重組細(xì)胞培養(yǎng)上清液介導(dǎo)熒光標(biāo)記siRNA進(jìn)入卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞內(nèi)的熒光

14、強(qiáng)度，同時(shí)用Lipofectamine2000(lipo2000)介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞作為陽性對(duì)照，對(duì)比融合蛋白轉(zhuǎn)染siRNA效率。
　　 5.Real Time RT-PCR檢測(cè)經(jīng)FSHβ/P1融合蛋白介導(dǎo)進(jìn)入顆粒細(xì)胞的siRNA沉默目的基因SMPD1效率。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建含F(xiàn)SHβ/protamine1融合蛋白的重組質(zhì)粒DAN3.1+/FSH-(GS)-P1。
　　 2.重組質(zhì)

15、粒pcDAN3.1+/FSHβ-(GS)-P1成功擴(kuò)增并經(jīng)酶切電泳鑒定，證實(shí)了酶切所得的基因片段大小與理論值相符，約600bp左右。
　　 3.成功構(gòu)建了表達(dá)融合蛋白FSHβ-(GS)-P1的單克隆CHO重組細(xì)胞。對(duì)重組細(xì)胞所提總RNA進(jìn)行RT-PCR，重組cDNA特異性引物擴(kuò)增所得DNA產(chǎn)物大小及堿基序列經(jīng)測(cè)序與理論值完全一致。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定融合蛋白定位于CHO重組細(xì)胞胞漿內(nèi)。Western blot鑒定融合蛋白的分子量大約

16、為21KD。ELISA鑒定融合蛋白可存在于CHO重組細(xì)胞培養(yǎng)上清液里，在細(xì)胞中呈分泌性表達(dá)。
　　 4.含有融合蛋白的CHO重組細(xì)胞培養(yǎng)上清液成功特異性介導(dǎo)siRN進(jìn)入卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)，而且轉(zhuǎn)染siRNA的效率高于Lipofectamine2000。
　　 5.Real Time RT-PCR結(jié)果顯示含F(xiàn)SHβ/protamine1融合蛋白的重組細(xì)胞上清介導(dǎo)siRNA進(jìn)入顆粒細(xì)胞能夠沉默目的基因SMPD1表達(dá)，SMPD1基

17、因的mRNA平均下降了50.05％。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建FSHβ/protamine1融合蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)，重組CHO細(xì)胞能穩(wěn)定分泌性表達(dá)融合蛋白。2.FSHβ/protamine1融合蛋白能特異性介導(dǎo)siRNA進(jìn)入卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)，兼有FSHβ亞基與卵巢顆粒細(xì)胞特異性結(jié)合的特性和魚精蛋白富含正電荷與帶負(fù)電荷的siRNA結(jié)合的活性。
　　 3.FSHβ/protamine1融合蛋白高效靶向介導(dǎo)針對(duì)SM