腹水來源的外來體用于卵巢癌免疫治療的實驗研究.pdf

1、外來體(exosomes)是一種膜性脂類囊泡，直徑30nm～90nm，可由多種細胞分泌，如B淋巴細胞、肥大細胞、不成熟DC、血小板、CTL、纖維原細胞、上皮細胞和腫瘤細胞。這些小囊泡來源于具有細胞膜的晚期多囊性的內(nèi)涵體或溶酶體，這些細胞以胞吞的方式攝取外來抗原在細胞內(nèi)形成多囊體(MVBs)，MVBs是一種復(fù)雜的胞內(nèi)細胞器，由胞吞作用產(chǎn)生。細胞膜先內(nèi)陷形成吞飲泡，吞飲泡的界膜再向內(nèi)出芽，形成許多小泡，這種胞吞腔室即為MVB。胞吞的主要功能

2、是對內(nèi)化的大分子和膜蛋白進行分類，一部分經(jīng)過MVB被轉(zhuǎn)運到溶酶體降解。另一部分移向質(zhì)膜，MVB的泡膜與質(zhì)膜融合后釋放小泡到胞外空間，這種小泡便是外來體。目前，從囊泡的形態(tài)、生化特點(蛋白、磷脂)和純化過程來定義外來體。 最近發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞也可釋放外來體，同時在腫瘤患者的腹水中也能分離出外來體，推測其來源于腫瘤細胞。腫瘤細胞釋放的外來體能夠包含和轉(zhuǎn)移抗原給樹突狀細胞，提呈給T淋巴細胞，引起CTL效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，外來體含有的成分如下

3、：①抗原呈遞相關(guān)分子：MHC-Ⅰ和Ⅱ類分子、HSC73、HSP70等；②免疫粘附及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子：ICAM-1、CD58、CD9、CD86/B7.2、Mac-1、MFG-E8等；③其它功能蛋白：AnnexinⅡ、TfR、CD55、CD59、Gi2等。因此，外來體可能具有細胞毒性效應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)凋亡和免疫耐受誘導(dǎo)等作用。將其用于腫瘤免疫治療的優(yōu)點是：非細胞成分、體積小易清除、穩(wěn)定性高、可按照GMP標(biāo)準(zhǔn)制備、可冷凍儲藏等。 目

4、前國內(nèi)外關(guān)于卵巢癌患者的腹水中分離出外來體作為特異性抗原用于免疫治療的研究較為少見，而運用臍血來源樹突狀細胞(DC)作為抗原提呈細胞，提呈外來體激活特異性細胞毒性T細胞(CTL)效應(yīng)的文獻尚無報道。本實驗從卵巢癌患者的腹水中分離出的外來體作了來源鑒定，并探討其是否能在卵巢癌的免疫治療中發(fā)揮作用以及對作用的途徑進行初步探討。 實驗分為四部分： 1.卵巢癌患者腹水中外來體的分離和免疫原性初步鑒定：采取10例晚期卵巢癌患者的腹

5、水(腹水內(nèi)癌細胞陽性)，通過低速離心、高速離心、超速離心和超濾等方法從腹水中分離出外來體，用電鏡進行形態(tài)學(xué)觀察，免疫電鏡和Westernblot方法鑒定MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子、HSP70和HSP90蛋白的表達，以探討外來體來源和初步免疫原性。 2.樹突狀細胞(DC)的誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定：取剖宮產(chǎn)兒臍血(CB)，用密度梯度離心法分離單個核細胞(MC)，體外用rhIL-4、rhGM-CSF和TNF-α定向誘導(dǎo)單核細胞增殖分化成D

6、C，計算擴增效率；光鏡、掃描電鏡和透射電鏡下觀察DC形態(tài)，免疫熒光法染色，流式細胞儀分析DC表面CD11c、CD80、CD86和HLA-DR的表達情況。 3.外來體用于卵巢癌免疫治療的體外實驗研究：重新培養(yǎng)CB-MC，并在培養(yǎng)第4d加入外來體，第7d加入TNF-α誘導(dǎo)DC成熟，第9d收集exo-DC，作為效應(yīng)細胞。收集卵巢癌患者外周血中的T細胞，與exo-DC混合培養(yǎng)3d，MTT法顯色，測OD值，計算T細胞刺激指數(shù)，做為代表ex

7、o-DC刺激T細胞增殖能力的指標(biāo)；exo-DC、exosomes、DC和PBS組分別與T細胞共培養(yǎng)3d，以激活T細胞成為CTL，將CTL與相對應(yīng)的自體腫瘤細胞按照不同的效靶比混合培養(yǎng)24h，MTT法顯色，計算殺傷率。 4.外來體用于卵巢癌免疫治療的體內(nèi)實驗研究：培養(yǎng)大鼠NuTu-19卵巢癌細胞系，分別將1×105、1×106和1×107個卵巢癌細胞注入3組8周齡的F344大鼠腹腔，建立卵巢癌腹水模型；抽取腹水分離鼠源外來體；抽取

8、大鼠尾血，分離PBMC，體外培養(yǎng)成鼠源DC，并在培養(yǎng)第5d加入外來體，第12收集鼠源exo-DC，分別給4組F344大鼠腹腔內(nèi)注射鼠源exo-DC、鼠源DC、鼠源外來體，對照組為PBS，隔1wk重復(fù)1次，每天觀察大鼠腫瘤的生長情況，計算存活率。 結(jié)果顯示： 1.外來體形態(tài)學(xué)電鏡觀察及免疫原性鑒定：從10例患者腹水中均分離出外來體，電子顯微鏡下可見，具有明顯異質(zhì)性圓形或橢圓形小囊泡，直徑約30～90nm，有完整的包膜，內(nèi)為

9、低電子密度物質(zhì)。通過免疫電鏡和Westernblot方法檢測發(fā)現(xiàn)：外來體上表達MHCⅠ類分子，HSP70和HSP90蛋白的表達，而無MHCⅡ類分子的表達。MHCⅠ類分子的含量為(0.21～1.34)×1014/mg蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的含量為0.992～5.068mg。 2.臍血中的單核細胞，在rhGM-CSF、rhIL-4和TNFα誘導(dǎo)后9d，電鏡下見到具有樹枝狀突起的細胞，掃描電鏡下見細胞表面有大量褶皺和粗細不等的樹枝樣突起，透射

10、電鏡下見到細胞形態(tài)不規(guī)則，表面伸出多級突起，細胞核清晰，胞漿內(nèi)線粒體豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，溶酶體可見。每2×106個臍血來源的單個核細胞可誘導(dǎo)出(1.05±0.21)×106個DC。第9d，細胞表型分析結(jié)果為：CD11c，76.1％，HLA-DR，68.0％，CD86，56.3％，CD80，54.8％。 3.DC與患者外周血來源的T細胞按不同的比例混合后，刺激指數(shù)SI值分別是(6.8±1.4)(1∶100)；(14.6±2.9)

11、(1∶20)；(24.6±2.4)(1∶5)。與腹水來源的卵巢癌細胞共孵育后，在效靶比為100∶1時，殺傷效率最大。其中P＜0.05(exo-DC組和exosome組)；P＜0.01(exo-DC組和DC組，exosome組和DC組，exo-DC組和T組，exosome組和T組)；P＞0.05(DC組和T組)。 4.1×107個NuTu-19大鼠卵巢癌細胞能夠在F344大鼠腹腔內(nèi)廣泛種植，100％產(chǎn)生腹水，組織中分離的癌細胞培養(yǎng)

12、和注射前的形態(tài)一致，鼠大網(wǎng)膜HE染色證實有癌細胞種植，所以成功建立卵巢癌腹水模型。從F344大鼠腹水中分離出外來體，外周血誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC，給4組大鼠靜脈注射后，exo-DC組的大鼠生存期延長。 結(jié)論：1、本研究經(jīng)過多步離心、超速離心和超濾等方法從卵巢癌患者的腹水中分離出外來體，特異性表達HSP70、MHCⅠ類分子和HSP90抗原。 2、貼壁的臍血單核細胞，在細胞因子rhGM-CSF100ng/mL和rhIL-450ng/

13、mL及rhTNF-α10ng/mL的配伍作用下，誘導(dǎo)分化成為具有典型形態(tài)和表型的DCs。 3、腹水來源的外來體+DC和單用外來體均能在體外激活同體T細胞，但外來體+DC作用更強，說明在DC存在條件下，外來體激活T細胞能力更強，使其成為特異性CTL。 4、從卵巢癌患者的腹水中分離、培養(yǎng)卵巢癌細胞，與激活的T細胞共同作用，CTL細胞能有效地殺傷卵巢癌細胞。 5、1×107個NuTu-19卵巢癌細胞可使F344大鼠在腹