TK-MCP-1融合基因治療卵巢癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文TKMCP1融合基因治療卵巢癌的實(shí)驗(yàn)研究姓名：張萍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：婦產(chǎn)科指導(dǎo)教師：孔北華20040501山東大學(xué)博士學(xué)位論文第一部分HSVtk／MCP。I融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定博士研究生：博士生導(dǎo)師：張萍孔北華教授摘要目的：構(gòu)建含有HSVtk和MCP—l融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。構(gòu)建分別含有HSVtk和MCP1單基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。方法；經(jīng)分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralblo

2、odmononuclearcell，PBMC)總RNA以反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription—polymerasechainreaction，RTPCR)方法擴(kuò)增MCP1基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后克隆至測(cè)序載體pUCmTvector，挑選陽(yáng)性克隆經(jīng)鑒定后測(cè)序，將測(cè)序正確的MCP1基因從測(cè)序載體相應(yīng)酶切位點(diǎn)消化后回收并純化。HSVtk目的基因片段來(lái)源于pWZLneoTKglyCD質(zhì)粒，IRES基因片段來(lái)源于MINV質(zhì)

3、粒。利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)將HSVtk基因與MCP—l基因連接并通過(guò)定向克隆方法插入至pLXSN表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間，連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5n感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選后隨機(jī)挑選陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，酶切鑒定插入片段的大小、位置，以獲縟含正確目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSN／tkMCPl。將目的基因HSVtk和MCP1從相應(yīng)酶切位點(diǎn)消化后，回收并純化，分別與經(jīng)同樣雙酶切后的線(xiàn)性化載體pLXSN連接，其后的轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定

4、方法與HSVtk／MCP一1融合基因表達(dá)載體基本相同，以分剮獲得含正確目的基因的真核表達(dá)載體pLXSN／HSVtk和pLXSN／MCP一1a結(jié)果：經(jīng)限制性酶切分析及PeR方法鑒定，各插入基因及融合基因的大小、位置和方向均正確無(wú)誤，從而成功構(gòu)建了pLXSNRkMCP—l、pLXSN／HSVtk和pLXSN／MCP—l三個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。結(jié)論：HSVtk／MCP1融合基因表達(dá)載體以及分別含HSVtk和MCP一1單基因表達(dá)載體的成功構(gòu)建為