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文檔簡介
1、目的:
軟組織創(chuàng)傷的經(jīng)久不愈和愈合后的瘢痕形成是臨床兩大難點,也是研究熱點。最新研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外來體(exosomes)在創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮積極作用。然而,脂肪干細(xì)胞(ASCs)來源的exosomes在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的作用及機制尚不清楚。本研究探討ASCs來源的exosomes對皮膚創(chuàng)傷愈合的主要效應(yīng)細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的生物學(xué)性能的影響,為促進(jìn)軟組織創(chuàng)傷愈合以及提高修復(fù)質(zhì)量提供理論依據(jù),也為臨床應(yīng)用提供新思路。
2、 方法:
?。?)構(gòu)建小鼠背部和腹股溝相同大小創(chuàng)傷模型,比較有脂肪層的腹股溝創(chuàng)口和無脂肪層的背部創(chuàng)口愈合快慢,并且創(chuàng)口組織免疫熒光檢測exosomes標(biāo)志蛋白CD63的表達(dá)情況;
?。?)從人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中提取出ASCs分泌的exosomes,采用透射電鏡,Nanosigtht,Western blot三種方法分別對其進(jìn)行形態(tài)學(xué),直徑分布,蛋白組學(xué)的鑒定;
?。?)將用CM-DiI熒光染料標(biāo)記過的exo
3、somes加入到成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)液,24h后熒光顯微鏡下觀察exosomes是否進(jìn)入到成纖維細(xì)胞里,參與調(diào)控成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為;
?。?)用不同濃度的exosomes(0,25,50,100ug/ml)刺激成纖維細(xì)胞,利用劃痕實驗和Transwell實驗檢測exosomes對成纖維細(xì)胞的遷移能力的影響,CCK-8法檢測對成纖維細(xì)胞增殖能力和RT-PCR法檢測對膠原合成的影響;
?。?)構(gòu)建小鼠背部創(chuàng)傷模型,將DIR熒
4、光染料標(biāo)記的exosomes通過鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi),活體成像儀檢測exosomes是否遷移到創(chuàng)口部位,參與創(chuàng)傷愈合過程;
?。?)采用Masson染色評估創(chuàng)口總體膠原纖維的表達(dá)情況,免疫組化檢測創(chuàng)口Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)情況,RT-PCR檢測創(chuàng)口Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA合成情況,同時計算創(chuàng)口愈合率。
結(jié)果:
?。?)發(fā)現(xiàn)含有脂肪組織的腹股溝部位創(chuàng)傷愈合更快,外來體標(biāo)志蛋白CD63免疫熒光結(jié)果顯示在該部位細(xì)胞分泌了更
5、多的外來體,發(fā)現(xiàn)脂肪組織對創(chuàng)傷愈合的積極影響,這提示可能跟exosomes有關(guān)。
?。?)通過透射電鏡的檢測顯示提取的粒子是圓形的囊泡樣結(jié)構(gòu)并且呈現(xiàn)典型的“杯口狀”,粒子的直徑大小約85%集中分布在30-100nm之間。同時,利用NanoSight儀器動態(tài)的觀察了外來體(exosomes)的直徑大小,濃度的檢測,以及布朗運動軌跡和動態(tài)追蹤視頻截圖,結(jié)果表現(xiàn)出和透射電鏡相似的實驗結(jié)果。通過蛋白免疫印跡法顯示提取出的粒子高表達(dá)外來體
6、標(biāo)志蛋白CD63和CD9。
?。?)體外示蹤實驗顯示exosomes可以進(jìn)入到成纖維細(xì)胞胞漿里,提示exosomes可以被成纖維細(xì)胞攝取。
(4)exosomes對成纖維細(xì)胞的遷移,增殖具有明顯的促進(jìn)作用,且具有濃度依賴性;exosomes可以顯著上調(diào)成纖維細(xì)胞的Ⅰ、Ⅲ型膠原和彈性蛋白的表達(dá),尤其是在50ug/ml這個濃度的作用最明顯。
?。?)體內(nèi)示蹤實驗發(fā)現(xiàn)exosomes可以遷移到創(chuàng)口周圍。
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